2.1. 시약 및 재료

Fenpyrazamine (99.3%) 표준품은 Sumitomo Chemical에서 제공받아 20.14 mg을 methanol 20 mL에 용해하여 1,000 μg/mL (1,000 ppm)의 표준원액을 조제하고, 이를 60% methanol로 희석하여 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 표준용액을 조제하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4 ^oC에 보관하여 실험에 사용하였다.

Acetonitrile, dichloromethane, acetone, n-hexane 등은 HPLC grade로써 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. Sodium chloride와 sodium sulfate anhydrous는 Wako (Osaka, Japan)로부터, formic acid 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 실리카 (silica) SPE 카트리지는 Waters (Milford, MA, USA)로부터 구입하였다. 검체는 국내 사용기준 설정을 위한 복숭아, 포도와 그 외의 농산물인 현미, 대두, 감자, 감귤, 고추 모두 무농약 농산물 을 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 -50 ^oC에 보관하고 실험에 사용하였다.

2.2. 추출 및 정제

검체를 분쇄하여 균질화한 후 20 g (곡류 및 콩류는 약 1 kg을 혼합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄한 20 g, 과일류, 채소류, 서류는 약 1 kg을 분쇄한 20 g)을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고(곡류 및 콩류의 경우 물 30 mL를 넣어 2 시간 방치) acetonitrile 100 mL를 가하여 진탕기에서 5 분간 진탕하였다. 이를 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인여과하였고, acetonitrile 20 mL로 잔사 및 용기를 씻어내어 앞의 여액과 합한 후 40 ^oC 이하의 수욕상에서 감압농축을 실시하였다. 이를 물 50 mL로 씻어서 500 mL 분액깔대기에 옮기고 포화식염수 20 mL 및 dichloromethane 100 mL를 차례로 가한 후 세게 흔들고 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 후 dichloromethane층을 satium sulfate anhydrous에 통과시켜 감압농축플라스크에 받는 과정을 2 회 반복하였 다. 이를 40 ^oC 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물을 n-hexane 4 mL로 재용해하고 실리카 카트리지 에 n-hexane 10 mL를 2~3 방울/초의 속도로 유출하여 버렸다. 이어서 고정상 상단이 노출되기 전에 추출 과정으로부터 얻은 n-hexane 4 mL에 녹인 액을 카트리 지 상단에 넣고 1~2 방울/초의 속도로 용출시켜 씻어버리고 고정상 상단이 노출되기 전에 hexane/acetone( 95/5, v/v) 10 mL를 유출시켜 버리고 hexane/acetone(85/15, v/v) 10 mL를 유출시켜 받은 시험액을 감 압농축플라스크에 취하였다. 이를 40 ^oC 이하 수욕상에서 감압농축하고 60% methanol 2 mL에 녹여 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다.

2.3. 기기분석

Fenpyrazamnie 분석을 위해 HPLC-UVD (High performance Liquid Chromatograph-ultraviolet detector)를 사용하였으며, Table 1에 기기분석 조건을 나타내었다. 분석법의 신뢰성을 확보하기 위해 LC-MS (Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)을 이용하여 Table 2에 나타낸 기기분석 조건에서 재확인 과정을 수행하였다.

Table1

Analytical conditions for the determination of fenpyrazamine residues

Table2

Confirmative conditions for identifying fenpyrazamine

2.4. 시험법 검증

본 연구에서 확립된 추출 및 정제 방법과 기기분석법을 검증하기 위해서 농약을 처리되지 않은 농산물 시료 에 처리농도 3 수준(0.05, 0.5, 5.0 mg/kg)으로 fenpyrazamine을 첨가하여 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하였고 이를 근거로 분석법의 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 구하였다.

3.1. 기기선정과 HPLC 분석조건 확인

Fenpyrazamine은 분자량 (331.4)이 크고 증기압이 2.89 × 10⁻⁸ Pa (25 ^oC)로 휘발성이 낮고 Log P_ow가 3.52로 중간 비극성인 화합물로 분자 구조상 pyrazole 구조가 있어 특정 UV에서 파장대에서 강한 흡광성을 나타낼 것으로 판단하여 fenpyrazamine 분석을 위해 HPLC를 분석기기로 선정하였다. 또한 칼럼은 fenpyrazamine이 비극성에 가까운 중간극성의 특징을 가지고 있는 것을 고려하여 HPLC에서 여러 종류의 시료에 범용적으로 사용할 수 있는 비극성 칼럼인 C₁₈을 사용하였다. 이에 HPLC-PDA 검출기를 이용하여 fenpyrazamine 표준용액 1.0 μg/mL를 210에서 400 nm 범위에서 스캔한 결과, 243 nm를 최적흡수파장으로 확인하였으며(Fig. 1) 이를 분석을 위한 파장으로 선택하였다. 이동상으로는 distilled water와 methanol을 사용하였으며 isocratic 조건에서 이동상 비율을 조 절하여 측정한 결과, distilled water/methanol 40/60 (v/ v) 비율에서 가장 우수한 효율을 보였다.

Fig. 1

HPLC-UVD spectrum of fenpyrazamine

확립된 기기분석 조건에서 fenpyrazamine의 직선성 (linearity)을 구하기 위하여 methanol로 희석하여 제조한 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 그리고 5.0 μg/mL의 표준용 액 20 μL를 HPLC-UVD에 주입하여 위에서 확립된 기기분석 방법으로 분석한 결과, 상관계수 (r) 0.9999 이상으로써 우수한 직선성을 보여주었다(Fig. 2).

Fig. 2

Calibration curve of fenpyrazamine standard solution.

3.2. 추출, 분배 및 정제과정 확립

Fenpyrazamine의 최적 추출 용매 선정을 위해 비극성의 잔류농약 추출에서 많이 사용되어지는 acetone, acetonitrile, methanol을 가지고 추출 효율을 비교하였다. 세 용매 모두 추출 효율이 95% 이상으로 효과적 이나 methanol의 경우 감압여과시 용매의 점성으로 인해 시간이 많이 소요되고 농축시에 bumping이 매우 심하다는 단점을 가지고 있고 acetone의 경우도 농축시 약간의 bumping이 있고 지방이나 색소 등의 공추 출물이 많아 간섭물질 제거에 어려움이 있었다. 따라서 이 실험에서는 공추출물이 적고 추출 효율도 가장 높은 acetonitrile을 추출 용매로 선정하였다.

첫 번째 정제과정에서는 액-액 분배법으로 극성추출액을 비극성 용매인 dichloromethane을 사용하여 극성이 높은 각종 간섭물질을 제거하였는데, dichloromethane 100 mL 씩 2 회 분배할 때 높은 분배효율과 회수율을 얻을 수 있었다. 두 번째 정제과정에서는 SPE 카트리 지를 이용하여 약한 강도의 용매로 fenpyrazamine은 충진물에 흡착시키고 그 이외의 비극성 간섭물질은 통과 시키고, 이어서 용매 강도를 증가시켜 fenpyrazamine은 충진물을 통과시켜 더 극성의 불순물은 충진물에 머무르게 하여 간섭물질을 제거하는 흡착방법을 사용하였 다. Fenpyrazamine은 중간 비극성 농약으로 흡착 원리에 의한 머무름으로 불순물과의 분리를 위해 hydroxyl 기를 작용기로 가진 흡착 카트리지인 florisil과 silica를 이용해 효율을 비교하였고, 이동상은 용출강도가 용매의 극성이 커지는 방향인 순상으로 hexane/acetone의 용매 조성을 사용하여 정제 효율을 비교해 본 결과, silica 카트리지가 florisil 카트리지보다 높은 회수율을 보였다(Table 3). 이는 florisil 카트리지의 경우 극성물질에 대한 강한 흡착성을 띄고 있어서 fenpyrazamine과 의 흡착이 silica 카트리지 보다 강하게 나타났다고 판 단되었다. 보다 효과적인 정제 효율을 알아보기 위해 용매 조성을 세분화하여 각 용매 조성에 대해 5 mL 씩 4 개의 fraction을 받아 정제 테스트를 진행한 결과 hexane/acetone (85/15, v/v) 10 mL에서 가장 높은 회수율을 보였다. 따라서 hexane/acetone (95/5, v/v) 10 mL 로 카트리지를 세척한 다음 hexane/acetone (85/15, v/v) 10 mL로 용출해 주었을 때 다양한 매트릭스 간섭 물질로부터 fenpyrazamine을 효과적으로 정제할 수 있었다

Table3

Comparisons of SPE cartridge and elution solvents for fenpyrazamine analysis

3.3. 실험실내 시험법 검증

회수율 측정은 분석법의 정확성, 재현성 및 효율성등을 판단하기 위한 과정이다.

Fenpyrazamine 시험법의 정확성을 평가하기 위하여 복숭아, 포도, 감귤을 포함하여 대표농산물 시료인 곡류 중 현미, 서류 중 감자, 채소 중 고추 및 콩류 중 대두 무처리군과 3 수준의 처리 농도(0.05, 0.5, 5.0 mg/kg)에 대해 회수율 실험을 5 반복으로 수행한 결과 평균 회수율은 71.8~102.7%이었고, 이때 상대표준 편차는 10% 미만으로 조사되어(Table 4) 국내 기준⁹ 및 국제식품규격위원회(Codex)의 잔류분석법 기준¹⁰을 만족하였다. Fenpyrazamine의 선택성 (selectivity)은 표준용액과 포도, 복숭아, 감귤, 고추, 대두, 현미의 무처 리 시료, 표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교함으로써 평가할 수 있었다. 무처리 시료와 회수율 시료는 확립된 시험방법에 따라 시험용액을 준비한 후 HPLC로 분석하였다. 무처리 시료 중 fenpyrazamine과 같은 머무름 시간을 갖는 어떤 방해물질도 검출되지 않음으로 검체 중 fenpyrazamine을 분 석하기 위해 본 시험법이 우수한 분리능과 선택성을 가지는 것으로 판단되며, 따라서 확립한 추출 및 정제조건의 높은 효율성과 적합성을 확인할 수 있었다. Fig. 3에는 포도, 복숭아, 감귤, 고추, 감자, 대두, 현미의 크로마토그램을 무처리군 및 농도별로 나타내었다.

Table4

Validation results of analytical method for the determination of fenpyrazamine residues in samples

^*Mean values of 5 times repetitions with relative standard deviation.

Fig. 3

HPLC-UVD chromatograms corresponding to grape (A); peach (B); mandarin (C); pepper (D); potato (E); soybean (F), and hulled rice (G): 1, control; 2, spiked at 0.05 mg/kg; 3. spiked at 0.5 mg/kg, and 4, spiked at 5.0 mg/kg.

3.4. 검출한계 및 정량한계

본 연구에서 확립한 시험용액 조제 및 기기분석법 을 이용하여 검체 중 fenpyrazamine의 분석기기의 검 출한계 (LOD, Limit of Detection)와 정량한계 (LOQ, Limit of Quantitation)를 구하였다. 검출한계는 최소 검출량이 2.0 ng (S, signal/N, Noise=3)이었고 아래의 계산식에 따라 0.01 mg/kg으로 나타났으며, 정량한계 는 최소 검출량이 10 ng (S/N=10)으로 아래의 계산식 에 따라 0.05 mg/kg으로 나타났다.

분석법상의 정량한계(LOQ)는 EU 가이드라인 (SANCO/10684/2009)¹¹에 따라 잔류분석법 기준이 만족 (회수율: 70 ~ 120%, RSD: ≤ 20%)되는 가장 낮은 첨가농도인 0.05 mg/kg으로 선정하였으며, 이는 국내⁹ 및 국제식품규격위원회 (Codex)¹⁰에서 권장하는 기준인 잔류허용기준의 1/2 또는 0.05 mg/kg 이하의 정량 한계에도 부합하여 이를 통해 본 분석법의 적합성을 확인할 수 있었다.

3.5. LC-MS를 이용한 분석법 재확인

본 연구에서 확립된 시험법을 이용하여 분석된 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위해 재확인 과정을 수행 하였다. LC 분석법을 통한 회수율은 머무름 시간대의 peak 면적으로 측정되기 때문에 분석대상 물질에 대한 선택성을 확보하기에 어려움이 있다. 따라서 fenpyrazamine 분석을 위해 개발된 시험법에 대한 신뢰성을 확보하고 물질에 대한 선택성과 정확성을 검증하기 위해 LC-MS(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)를 이용한 분석법 재확인 필요하며 이러한 LC-MS 분석은 분석대상 성분의 분자구조로부터 유도되는 분자이온과 주요 fragment ion을 확인함으로써 보다 정확한 정성확인을 가능하게 한다.^12,13

검체 분석의 재확인을 위한 LC-MS에서 이온화는 fenpyrazamine 분자내에 ion pair를 갖고 있는 질소 원 자가 다수 존재하므로 porotonation이 용이하여 이온 화법으로 electrospray ionization법을 사용하였고 위의 분석조건에서 얻은 total ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum으로 selected-ion monitoring (SIM) 분석 을 위한 최적 특성이온을 선정하였다. 질량이 331인 fenpyrazamine 표준용액 (1.0 μg/mL)을 10 μL/min 속 도로 질량검출기에 직접 주입한 결과 질량이 332인 (M+H)+ 형태로 나타났다. 피크 강도에 가장 큰 영향 을 미치는 cone voltage를 확인하기 위하여 LC-MS에 주입하는 fenpyrazamine량을 일정하게 하여 cone voltage의 변화 (10 ~ 70 V)에 따른 피크 강도의 차이 를 알아보았다. 30 V에서 최대의 peak 강도가 나타나 며 30 V 전후의 voltage에서는 peak 강도는 감소가 일어남을 확인할 수 있었다. 70 V 이상에서는 trace 정도로 나타났다. 또한 이를 ion spectrum에서 확인하고자 동일한 조건에서 scan mode로 확인한 결과 SIR 모드 결과와 동일한 결과를 나타내어 fenpyrazamine 분석 시 최적의 cone voltage는 30 V임을 확인할 수 있었다. 따라서 cone voltage 30 V에서의 fenpyrazamine 의 full scan mass spectrum 분석 결과 332 m/z가 최 적화됨을 알 수 있었고 위의 조건에서 분석한 결과 fenpyrazamine의 머무름 시간은 9.9분이었다(Fig. 4). 분석법 검증 대상 농산물인 복숭아, 포도, 감귤, 고추, 현미, 대두 및 감자의 모든 시료에 대해 LC-MS로 분 석한 결과, 물질에 대한 우수한 선택성을 확인함으로 써 본 연구에서 개발한 분석법에 대한 높은 신뢰성과 정확성을 확보할 수 있었다.

Fig. 4

Full scan mass spectrum of fenpyrazamine and chromatogram of fenpyrazamine standard solution at 1.0 μg/mL