2.1. 실험재료

시험물질로 사용된 참당귀 추출분말은 뉴트라젠으로부터 공급받았다. 골관절염 유발에 사용된 MIA는 Sigma Co. (St. Louis, MI. USA)에서, 동물마취제인 Zoletil과 Rompun은 바이엘코리아(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포독성 측정에 사용된 water-soluble tetrazolium salt (WST-8) 실험은 Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan)를 사용하였으며, 염증성 사이토카인의 측정은 각각의 assay kit를 구입하여 ELISA Reader 또는 Western blot으로 검출하였다.

2.2. 실험동물

6 주령의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(Orientbio, Korea) 60 마리를 구입하여 충북대학교 동물사육실 내에서 온도 23±2 ℃, 습도 55±5%, 12시간 주기의 명암 조건에서 1주간 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 사료는 실험동물용 사료(Samyang Co., Korea)와 멸균된 음용수를 자유로이 공급하였다.

2.3. 골관절염 유발

사육실에서 1주간 적응을 거친 실험동물의 체중을 측정하여 각 군당 12마리씩 5개군(정상군, 대조군, 처리군 1, 처리군 2 및 처리군 3)으로 고르게 배정하였다. 골관절염 유발을 위하여 Zoletile과 Rumpun이 2:1 비율로 희석된 마취제를 흰쥐에 투여하여 마취시킨 후, 양쪽 무릎주변을 깨끗이 제모하고 1 mL 주사기를 이용하여 양쪽 슬관절강 내에 생리식염수로 희석된 MIA (30 mg/mL 용액) 0.1 mL을 주사하였다. 정상군(N)은 양쪽 슬관절강 내에 각각 주사용 생리식염수 0.1 mL을 주사하고, 증류수 1 mL을 3주간 1일 1회씩 경구 투여하였다. 대조군(C)은 양쪽 슬관절강내에 MIA 용액 0.1 mL을 주사하여 골관절염을 유발시키면서 증류수 1 mL을 3주간 1일 1회씩 경구 투여하였다. 참당귀 추출분말 처리군은 양쪽 슬관절강 내에 MIA 용액 0.1 mL을 주사하여 골관절염을 유발시키면서 참당귀 추출분말을 각각 25, 50 및 100 mg/kg 농도로 희석한 시험물질 1 mL을 3주간 1일 1회씩 경구 투여하였다.

2.4. 세포독성 측정

본 연구에 사용된 토끼 연골조직세포(chondrocyte)는 2~3주령 New Zealand white 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하여 1차 배양한 후, 사용하였다. 토끼 연골세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다

참당귀 추출분말의 세포독성 유무를 알아보기 위하여 Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan)를 이용하여 WST assay를 실시하였다. 연골조직세포를 96 well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하고 12시간 배양한 다음, 참당귀 추출분말을 농도별(0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL)로 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well 당 10 μL의 WST-8 용액을 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 3시간 반응시킨 후, ELISA reader (BIO-TEK Instruments Inc., Power wave X340, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험값은 참당귀 추출분말을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.¹⁴

2.5. Nitric oxide (NO) 생성량 측정

참당귀 추출분말의 NO 생성 억제능을 알아보기 위하여 Griess reagent 반응법을 이용하였다. 토끼 연골 조직세포를 96 well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종하고 12시간 배양한 다음, IL-1α (interleukin-1α, Miltenyi Biotec., Germany)를 단독 또는 다양한 농도(0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL)의 참당귀 추출분말과 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액에 동일한 양의 Griess reagent (1% sulfanilamide 및 0.1% N-[1-naphthy] ethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid)를 첨가하고 실온에서 10분간 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 농도는 NaNO₂ 표준액을 이용하여 정량곡선을 작성한 후, 이를 기준으로 계산하였다.

2.6. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 측정

참당귀 추출분말이 iNOS (inducible nitric oxide), COX-2 (cyclooxygenase-2), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β (interleukin-1β) 및 IL-6 (interleukin-6) 유전자 발현 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 참당귀 추출분말이 투여된 흰쥐에 MIA를 주사하고 2일이 경과한 시점에서 연골을 적출하여 분쇄한 후, total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology Inc., Korea)를 이용하여 연골조직으로부터 total RNA를 분리하였다. Total RNA를 정량하고, RT-PreMix (iNtRON Biotechnology Inc.)를 이용하여 1 μg씩 동일한 양의 각 total RNA로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 β-actin 등 각각의 유전자에 해당되는 프라이머를 사용하여 94 ℃ 1분, 50~65 ℃ 45초, 72 ℃ 1분, 총 30 cycles 조건으로 RT-PCR을 수행하였다(Table 1).¹⁵

Table1.

RT-PCR primers for inflammatory enzymes and cytoknes

2.7. iNOS 및 COX-2 단백질 발현 측정

참당귀 추출분말이 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 수행하였다. 참당귀 추출분말이 투여된 흰쥐에 MIA를 주사하고 2 일이 경과한 시점에서 연골을 적출하여 분쇄한 후, Lysis buffer (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)를 이용하여 연골조직 내 단백질을 수집하였다. BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질 농도를 측정한 후, 20 μg씩 동일한 양의 각 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동하고, nitrocellulose membrane (Whatman, Dassel, Germany) 상으로 이동시켰다. 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 membrane에 5% 탈지분유를 넣고 1시간 반응시킨 다음, iNOS (BD, USA), COX-2 (Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) 및 β-actin (Sigma) 항체가 첨가된 5% 탈지분유로 교체하여 4 ℃에서 12시간 반응시켰다. TBST (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 5분간 3회 세척하고 각각에 대한 이차항체로 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 용액 (Amersham Pharmacia Biotech., NJ, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 확인하였다.

2.8. 흰쥐 혈청중 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량 측정

MIA 주사 후 2일이 경과한 흰쥐의 혈액에서 혈청을 분리한 뒤, 염증성 지표로서 TNF-α, IL-1β, IL-6 등을 ELISA assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)를 이용하여 측정하였다.

2.9. 참당귀 추출물 성분분석

혈액 내의 decursin과 decursinol의 분석을 위한 LC-MS/MS는 기기는 LCQ FLEET ESI-Ion trap mass (Themo scientific, FL, USA)를 사용하였으며, Plus (Themo scientific, FL, USA)를 연결하여 system을 사용하였으며 소프트웨어는 X-calibur software (Themo scientific, FL, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석에 이용된 컬럼은 LUNA C18 (2.0 × 150 mm, 5 μm, Phenomenex, USA)를 사용하였다.

이동상 조건은 0.1% 개미산 수용액 (A)과 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 용액(B)로 구성되어 gradient 분리 방법을 사용하였다. 용매 비율은 0-4 min (30→90, B), 4-4.5 min (90→30, B)로 설정되었으며, 유속은 0.3 mL/min으로 하였고, 주입량은 10 μL 였다.

LC/MS/MS 분석 조건으로 MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode에서 monitor되었으며, electrospray ionization (ESI) positive ion mode를 사용하였다. Decursin과 decursinol 분석은 positive ion mode에서 시행하였으며 decursin의 이온화 monitoring은 m/z 329>229>211로 decursinol의 이온화 monitoring은 m/z 247>229로 분석하였다.

Desolvation gas로 질소를 사용하였으며, decursin과 decursinol 분석을 위한 collision energy는 각각 23와 17%이었으며, ESI source temperature는 300 ℃로 설정하였다.

참당귀 추출분말의 주성분인 decursin의 혈장내의 농도변화를 관찰하기 위하여 decursin 0.2 mg을 전혈, 혈장 및 세포배양한 여액에서 2시간 배양한후, decursin (m/z 329→229→211) 및 decursinol (m/z 247→229)을 LC-MS/MS로 모니터링하였다. 혈중 농도를 측정하기 위하여 흰쥐에 decursin (10 mg/kg)을 i.p.주입 후 시간경과에 따른 decursinol의 함량을 LC-MS/MS로 측정하였다.

2.10. 통계처리

본 연구에서 얻은 정량적인 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t-test를 이용하여 통계처리하였으며, 유의성은 *p<0.05 및 **p<0.01수준에서 검정하였고 그 값은 평균(mean)±표준편차(standard deviation)로 표기하였다.

3.1. 세포독성 측정

토끼 연골조직세포에 참당귀 추출분말을 농도별(0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL)로 처리하여 24시간 배양한 후, WST방법으로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 세포 증식에 영향을 미치지 않았으며 실험에 사용된 모든 농도에서 100% 이상의 세포생존율을 보임에 따라 참당귀 추출분말 처리에 따른 연골조직세포에 독성을 유발하지 않았다.

Fig. 1.

Effect of Angelica gigas extract powder on the viability of rabbit chondrocytes. Rabbit chondrocytes were incubated with the indicated concentrations of Angelica gigas extract powder for 24 hr. Cell viability was determined by the WST assay.

3.2. NO 생성 억제

IL-1α 처리로 염증을 유발한 토끼 연골조직세포에 참당귀 추출분말을 농도별(0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL)로 처리하여 24시간 배양한 후, NO 생성량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 IL-1α만 처리한 군의 NO 생성량은 약 18 μM로서 IL-1α를 처리하지 않은 군에 비해 약 10배 가량 NO 생성량이 증가하였다. 따라서 IL-1α처리 농도 (5 μg/mL)에서 효과적으로 염증유발 효과가 유발되는 것을 확인 할 수 있었다. 본 실험 계에서의 NO생성은 참당귀 추출분말처리로 농도 의존적으로 감소하였으며, 25 μg/mL 이상의 농도에서는 통게학적 유의성 및 효과적으로 NO 생성을 억제하였다. 따라서 강력한 염증성 cytokine인 IL-1α 처리로 급격하게 생성된 NO함량은 참당귀 추출분말 50 μg/mL 처리로 약 6.0 μM 농도까지 감소하였으며 비처리군 (약 1.8 μM)에 대하여 3배 정도의 량까지 NO생성을 효과적으로 억제하였다.

Fig. 2.

Effect of Angelica gigas extract powder on the production of NO in IL-1α-stimulated rabbit chondrocytes. Rabbit chondrocytes were stimulated with Angelica gigas extract powder (0-50 μg/mL) in the presence or absence of IL-1α (5 μg/mL) for 24 hr. Supernatants were collected and the NO concentration from the supernatants was determined by the Griess reagent assay. Data are expressed as the percentage of control. All values were presented as mean±S.D (n=6). Values with asterisk are significantly different at **P<0.01 by Student’s t-test.

3.3. iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제

참당귀 추출분말 투여에 의한 NO 생성의 억제 기전을 조사하기 위하여, 참당귀 추출분말이 투여된 흰쥐에 MIA를 주사하고 48시간 경과후, 연골조직 내 NO생성 효소인 iNOS의 mRNA (A) 및 단백질 (B) 발현정도를 조사하였다(Fig. 3). MIA만 투여한 대조군 (C)에서는 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현이 모두 크게 증가하였으며, 참당귀 추출분말 처리(25, 50 및 100 mg/kg)는 iNOS mRNA 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 따라서 참당귀 추출분말은 iNOS를 유전자 레벨에서 발현을 억제하여 MIA처리로 유도된 염증유발인자 NO의 생성을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 참당귀 추출분말은 이미 알려져 있는 염증신호전달 경로에서 중요한 역할을 담당하는 MAP kinases활성화를 통하여(JNK 및 p38) 핵내의 AP-1에 다다르는 경로의 일부를 억제할 것으로 추정할 수 있다.¹⁶

Fig. 3.

Effect of Angelica gigas extract powder on the mRNA and protein expressions of iNOS in cartilage from knee joints of rats at 2 day after MIA injection. The mRNA (A) and protein (B) expressions of iNOS in cartilage from knee joints of rats at 2vday after MIA injection was determined by RT-PCR and western blot. Data are shown as Mean±S.D (n=10). N: intra-articular saline injected and treated with distilled water. C: intra-articular MIA injected and treated distilled water. 25: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (25 mg/kg). 50: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (50 mg/kg). 100: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (100 mg/kg).

3.4. COX-2 mRNA 및 단백질 발현 억제

참당귀 추출분말이 iNOS발현과 공통 신호전달 경로를 갖는 COX-2 유전자 및 단백질 발현에서도 재현성 있게 억제하는 지를 확인하기 위하여 참당귀 추출분말이 투여된 흰쥐에 MIA를 주사하고 48시간 경과 후, 연골조직 내 COX-2의 mRNA (A) 및 단백질 (B) 발현을 측정하였다. Fig. 4A, B에 나타낸 바와 같이, 정상군(N)에서 COX-2 mRNA 및 단백질 발현은 아주 미약하였으며 대조군(C)에서는 MIA처리로 인하여 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현이 크게 증가되었다. 동일한 조건에서 참당귀 추출분말을 농도 의존적으로 처리(25, 50 및 100 mg/kg)한 결과, COX-2 mRNA 및 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 특히 COX-2 단백질 발현의 감소(Fig. 4B)는 염증성 prostaglandin (예를들어 PGE₂)류를 다량 생성하여 염증반응을 증폭하여 염증성 백혈구를 동원하게 되어 염증의 악화를 초래하므로¹⁷ 본 실험결과, 참당귀 추출분말은 이 단계를 효과적으로 차단할 수 있을 것으로 생각한다.

Fig. 4.

Effect of Angelica gigas extract powder on the mRNA and protein expressions of COX-2 in cartilage from knee joints of rats at 2 day after MIA injection. The mRNA (A) and protein (B) expressions of COX-2 in cartilage from knee joints of rats at 2 day after MIA injection was determined by RT-PCR and western blot. Data are shown as Mean±S.D (n=10). N: intra-articular saline injected and treated with distilled water. C: intra-articular MIA injected and treated distilled water. 25: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (25 mg/kg). 50: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (50 mg/kg). 100: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (100 mg/kg).

3.5. TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 억제

LPS등으로 유발되는 염증인자인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 참당귀 추출분말이 투여된 흰쥐에 MIA를 주사하고 48시간 경과 후, 연골조직 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과 정상군 (N)에서는 염증성 인자들의 발현이 매우 미약한 반면, MIA를 처리하면 대조군(C)의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 공통적으로 매우 증가하였다. 참당귀 추출분말을 농도 의존적으로 처리한 결과 모든 염증성 인자의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 참당귀 추출분말은 TNF-α mRNA 발현은 미약하게 감소하였으나 IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현은 크게 억제하였다. 따라서 참당귀 추출분말은 TNF-α 발현에 직접 작용하는 것이 아니라 TNF-α 신호전달계의 하류에 위치한 IL-1β 및 IL-6의 생성경로를 차단하는 것으로 추정할 수 있었다.

Fig. 5.

Effect of Angelica gigas extract powder on the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines in cartilage from knee joints of rats at 2 day after MIA injection. The mRNA expression of pro-inflammatory cytokines in cartilage from knee joints of rats at 2 day after MIA injection was determined by semi-quantitative RT-PCR. Data are shown as Mean±S.D (n=10). N: intra-articular saline injected and treated with distilled water. C: intra-articular MIA injected and treated distilled water. 25: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (25 mg/kg). 50: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (50 mg/kg). 100: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (100 mg/kg).

3.6. 혈청 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 단백질 농도에 미치는 영향

참당귀 추출분말의 항염증효과가 염증부위에만 국소적으로 작용하는지 전체적으로 항염증효능을 발휘하는지 구분하기 위하여 동일한 조건에서 MIA 주사 후, 48 시간 경과 후, 심장에서 채취한 흰쥐의 혈청에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량을 측정하였다. TNF-α의 함량은 대조군(C)에서 100±4.9%였을 때, 정상군 (N)은 63.2±5.2%, 처리군 각각은 95±3.8, 87.6±5.1 및 79.2±6.7%로 나타남에 따라, 참당귀 추출분말이 혈청내의 염증성 인자의 감소를 초래함을 알 수 있었다(Fig. 6). IL-1β의 함량 변화도 유사한 패턴을 나타냈으며 대조군에서 100±5.8%의 값에 비하여 정상군은 61.2±6.4%, 처리군 각각은 90.5±8.2, 73.1±4.1 및 68.4±6.0%로 감소하였다. 마찬가지로 IL-6의 함량은 대조군에서 100±3.9%였을 때, 정상군은 63.9±4.7%, 처리군 각각은 89.0±6.5, 72.6±6.1 및 69.3±4.2%로 나타남에 따라, 참당귀 추출분말은 혈액중 염증성 인자들의 농도를 유의성있게 낮추는 것을 확인하였다. 따라서 참당귀 추출분말의 효능은 염증성 국소부위에 머물지 않고 몸 전체의 염증성 신호전달 경로를 차단하는 사실을 확인하였다.

Fig. 6.

Effect of Angelica gigas extract powder on the production of pro-inflammatory cytokines in the serum of rats at 2 day after MIA injection. Data are shown as Mean±S.D (n=10). N: intra-articular saline injected and treated with distilled water. C: intra-articular MIA injected and treated distilled water. 25: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (25 mg/kg). 50: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (50 mg/kg). 100: intra-articular MIA infected and treated with Angelica gigas extract powder (100 mg/kg). Statistically singnificant value compared with control by t-test (*p<0.05).

우리는 이전의 결과에서 골관절염 발병의 바이오마커로서 활액내 연골조직의 주성분인 glycosaminoglycan(GAG)의 함량 및 관절연골 조직내 proteoglycan(PG)의 함량이 MIA의 염증유발에 의하여 줄어드는 현상이 참당귀 추출분말을 함께 투여함으로써 개선된 결과를 발표한 바 있다.¹⁸ 염증성 cytokines, TNF-α, IL-1β 및 IL-6등의 발현이 증가하면 관절연골의 생성에 관여하는 chondrocytes의 PG생성 및 collagen type II의 생성 등이 억제되면서 결과적으로 chondrocyte의 사멸 및 골관절 부위의 파괴가 일어나기 시작한다. 참당귀 추출분말은 염증 발병 초기단계에 급격히 생성되는 염증성 cytokines과 염증성 매개물질인 NO, prodtaglandins을 산생하는 iNOS 및 COX-2의 발현 및 활성을 억제함으로써, MIA로 유발된 골관절염 유발을 초기단계에서 예방할 수 있음을 확인하였다.

3.7. 참당귀 추출분말 성분의 분석

참당귀 추출분말의 주성분인 decursin을 전혈, 혈장 및 HUVEC세포 배양액에서 2시간 후 decursin를 LC-MS/MS로 분석한 결과, decursin은 전혈에서 약 75% 및 혈장에서 약 30% 정도 decursinol로 전환되었다. 한편, 세포배양액에서는 decursinol이 생성되지 않았다(Fig. 7). 따라서 참당귀추출물 투여시 decursin의 일부가 decursinol로 전환되어 항염증 활성을 나타내는 것으로 추정된다. Decursinol이 Caco-2세포 단층막 투과실험에서 높은 투과율(>14×10⁻⁶ cm/s)을 보이고, 경구투여시 45%이상의 높은 생체이용율 (bioavailability)를 나타냄에 따라,¹⁹ 참당귀 추출분말의 decursin이 decursinol로 전환, 흡수되어 골관절염으로 유발된 염증성 cytokines을 억제하는 것으로 추정할 수 있다.

Fig. 7.

Decursin was converted in decursinol in whole blood, rat plasma, and not in HUVECs media in 2 hrs incubation. Decursinol and decursin were analyzed by LC-MS/MS in indicated MRM mode. HUVECs: human umbillical vein endothelial cells.

한편, decursin (10 mg/kg)을 흰쥐에 복강투여 후, 전환된 decursinol의 혈중 농도를 모니터링한 결과, 혈장 최대농도 2.75 μg/mL (30 min)로 나타났으며, 약 8시간 후에도 혈장 중에 잔류함을 알 수 있었다(Fig. 8). 본 논문에서는 decursin을 단독 투여하는 경우와 decursinol을 단독 투여하는 경우에 대한 항염증 활성을 비교하지 않았으나, 본 연구에 사용한 참당귀 추출 분말에는 decursin: decursinol angelate의 함량비가 약 2:1 이므로,¹⁸ 이들중 흡수된 성분의 대부분이 2시간 이내에 decursinol로 전환되는 것으로 추정된다.

Fig. 8.

Blood concentration of decursinol in vivo after i.p. injection of decursin. The intraperitoneal (i.p.) injection of decursin (10 mg/kg: 100 μL injection) was effectively converted into decursinol which shows maximum concentration at 30 min.