2.1. 시약 및 기구

Dichloromethane, acetone, acetonitrile, n-hexane, methyl t-butylether는 Wako사의 잔류농약시험용을, methanol은 Fischer chemicals의 HPLC용을, acetic acid은 Wako사의 비수적정용을 사용하였다. Phenol은 Kanto Chemical, 1.0 mg/mL의 표준원액을 methanol로 희석해서 실험에 적당한 표준용액을 조제하여 사용하였다.

고체상 추출 카트리지는 수질시료에 가장 보편적으로 사용되는 Water사의 Sep-pak tC₁₈ Environmental cartridge과 Oasis HLB 3 cc/60 mg cartridge, 6 cc/200 mg cartridge 사용하였으며, 용출장치는 Alltech사의 Vacuum Manifold (Alltech Associates, Illinois, USA) system을 사용하였다.

2.2. 분석기기 및 분리

분석에는 형광검출기(G1315B)와 Photodiode array detector (G1315B)가 부착된 Agilent Technologies사의 HP1100 series HPLC system과 MSD (G1956B)와 UV (G1315B)가 부착된 HPLC system을 두 가지 system을 사용하였다. 분리 분석컬럼은 Alltech사 (Alltech Associates, Illinois, USA)의 ADSORBOSPHERE XL C8 300A 5U (ID 4.6 mm, Length 250 mm)을 사용하였다. 형광검출기를 사용하는 system에선 λ_ex 215 nm, λ_em 313 nm에서 검출하였으며, 이동상은 비저항값 18 MΩ 이상인 증류수에 1% acetic acid 용액과 HPLC용 methanol에 1% acetic acid를 첨가한 용액을 membrane filter하여 Table 1과 같이 gradient elution하였다. MSD를 사용하는 시스템에서 이동상은 단순히 75% methanol 사용하였으며 자세한 조건은 Table 2에 나타내었다.

Table 1.

Operating conditions for high performance liquid chromato-graphy with fluorescence detector

Table2.

Operating conditions for high performance liquid chromato-graphy with mass selective detector

2.3. 고체상추출법

시료는 0.45 μm GF/C filter (Whatman)를 이용하여 여과하고, 화합물의 변화를 방지하고 추출효율을 최적화시키기 위하여 묽은 인산으로 pH 3이 되도록 조정한 후 일정량을 취하여 분석용 시료로 한다.

사용할 카트리지는 미리 5 mL의 디클로로메탄으로 흘려주고 이어서 메탄올 5 mL, 증류수 5 mL를 이어서 흘려주어 활성화시킨다. 후에 위에서 전처리된 시료를 활성화된 카트리지에 5~10 mL/min의 유속으로 흘려 통과시킨다. 시료를 모두 통과시킨 다음 수분이 제거되도록 충분히 air-aspiration한 후 메탄올 5 mL로 용리시키고(Scheme 1), 용리액을 40℃ 항온수조에서 질소기체를 이용하여 1 mL까지 농축한 다음 Table 1과 2의 조건으로 조절된 HPLC/FLD와 HPLC/MSD에 주입하여 분석한다. 형광검출기의 검출한계는 s/n=5일때 피크면적으로 계산하면 0.05 ng 이고 질량분석기의 검출한계는 s/n=5 일때 피크면적으로 계산하면 0.4 ng 이다.

Scheme1.

Flow chart of sample preparation by solid-phase extraction.

3.1. 고속액체크로마토그래피/형광검출기에 의한 페놀분석

수질중의 페놀을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석하여 보았다. 페놀 및 페놀성 화합물은 극성이 크고 acidic hydroxy group을 가지고 있어 일반적인 가스크로마토그래피로는 미량분석이 어려워 보통 유도체를 만들어서 분석하는 것이 일반적인 방법이다.^12-14 그러나 고속액체그로마토그래피법을 이용할 경우에는 이러한 유도체과정 없이 분석할 수 있기 때문에 최근에는 페놀 및 페놀성화합물의 분석에 많은 연구가 보고되고 있다.^1,2,9 대부분의 경우는 UV등을 이용해서 분석하나 본 연구에서는 형광검출기와 질량선택성검출기를 이용하여 분석하였다. 이동상은 여러 가지가 보고되고 있으나 간단한 용매를 사용하기위하여 물/메탄올계를 사용하였으며, 추후에 클로로페놀등 페놀성 화합물과 동시분석에 이용하기위하여 아세트산이 첨가된 이동상을 이용하였다. 분석에 사용된 고속액체크로마트그래프의 컬럼은 예비실험결과 ODS 컬럼보다 분리능이 좋고 피크 끌림이 적게 나타나는 Octyl(C₈)의 역상컬럼을 사용하였다. 검출기는 페놀에 대하여 감도가 훨씬 좋은 형광검출기를 선택하여 사용하였으며, 여기파장(λ_ex) 215 nm, 형광파장(Em) 313 nm에서 측정하였다. Table 1의 조건에 따라 분석한 크로마토그램은 Fig. 1과 같으며, 이때 페놀의 검출한계 (limit of detection)는 s/n=5에서 0.05 ng 이었다.

Fig.1.

Chromatogram for phenol of HPLC/FLD.

3.2. 고속액체크로마토그래피/질량분석기에 의한 페놀분석

형광검출기보다 감도는 떨어지나 메트릭스(방해 물질)가 복잡한 시료에서 정확한 정성 및 정량분석을 위하여 질량분석기를 이용하는 것이 효과적이라는 것은 주지의 사실이다. 본 연구에서도 형광검출기의 검출한계 0.05 ng (s/n=5) 이고 질량분석기의 검출한계 0.4 ng (s/n=5)로 측정되어 10 배 정도 질량분석기의 감도가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 그러나 메트릭스(방해물질)가 복잡한 오·폐수등의 수질시료에서는 페놀의 검출시간대에서 피크가 나타나는 등 겹침피크가 나타날 가능성이 높아 정확한 분석을 위하여 질량분석기를 이용하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.

페놀의 경우 이동상을 HPLC/FLD의 조건과 동일한 용매를 사용하는 경우에 phenol의 극성과 산성도 때문에 이온의 형성이 원만하지를 않을 뿐만 아니라 acetate의 영향으로 이온의 생성이 어려우므로 물과 메탄올을 사용하는 용매계를 선택하였다. HPLC/MSD를 사용하기 위하여 먼저 FIA (flow injection analysis)를 실시하여 최적의 이온화 상태를 만들어 주는 전압을 설정하여야한다(이 값을 fragmentor voltage라함). 페놀의 polarity mode는 negative였고 최적의 fragmentor voltage는 Fig. 2에 나타낸 것과 같이 150 V였다.

Fig.2.

FIA (flow injection analysis) chromatogram of UV (upper) and MSD (lower) at fragmentor voltage 130~170 V and API-ES negative mode.

Table 2에 나타낸 MSD 조건하에서 Fig. 3와 같은 TIC 크로마토그램을 얻을 수 있었다.

Fig.3.

Chromatogram of UV detector at 230 nm (upper) and Total ion chromatogram of mass selective detector (lower) for phenol standard solution.

그림에서 위의 것은 비교를 위하여 UV 검출기 파장 230 nm에서 동시에 측정한 크로마토그램이고, 아래의 것이 MSD에서 얻은 TIC 크로마토그램이다. 그림에서 보듯이 잘 분리가 된 크로마토그램을 얻을 수 있었다.

TIC 크로마토그램으로부터 얻어진 MS spectrum을 Fig. 4에 나타내었다. LC에의한 mass spectrum은 GC에의한 것과는 조금 다른 양상을 나타낸다. LC에서는 현재 API (atmospheric pressure ionization) sources에 의하여 분석이 이루어지기 때문에 molecular ion peak나 M-1 또는 M+23 피크가 base peak로 나타난다. 페놀의 분석에서도 M-1 (m/z=93) 피크를 base peak로 하여 M·(m/z=94), M-(OH group) (m/z=77)이 정확하게 나타나 페놀임을 확인 할 수 있었다.

Fig.4.

Liquid chromatographic mass spectrum for phenol.

3.3. 고체상추출법

본 연구에서는 페놀을 정제 농축하기 위한 방법으로 고체상추출법을 사용하였다. 고체상 추출법도 크로마토그래피와 같이 순상, 역상의 기법이 이용되며, 수질시료와 같이 극성이 큰 용매에 용해되어 있는 시료에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 방법이 순상기법을 이용하는 것이다.⁸ 순상기법에 사용되는 대표적인 카트리지가 ODS 계열이며, 수질시료와 같이 수용성시료에 대하여 C₁₈카트리지가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 페놀과 같이 극성이 크고 이온성인 화합물의 경우에는 적합하지 않아 본 연구에서는 고분자 흡착제를 이용한 Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic-Balance) 카트리지를 사용하였다.¹⁶ 이는 친유기성 부분인 divinylbenzene과 친수성 부분인 N-vinyl pyrrolidone의 두 단위체가 결합된 Copolymer를 사용한 것으로 일반적인 카트리지 충전제와는 달리 수용성과 지용성 시료에 모두 적용가능하다. 먼저 고체상에 흡착된 페놀을 가장 효과적으로 용출할 수 있는 용매를 선택하기 위해서 t-butyl methyl ether, acetone, acetonitrile, methanol로 각각 실험하였다. 활성화 시킨 각각의 cartridge에 페놀 표준용액 5.0 ng을 주입시키고 선택된 각각의 용매 5 mL로 elution시켜 분석하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이 tC18에서는 모든 용매에서 평균이 6.2%~7.8%로 비슷하였으며, HLB에서는 거의 모든 용매에서 80%이상을 나타내었으나, 메탄올이 가장 높았다. 따라서 회수율도 좋고 사용하기도 편리한 메탄올을 용출용매로 선정하였다.

Table3.

Recoveries(%) for different elution solvent of phenol in 0.5 ng spiked water samples (where MTBE is methyl t-butyl ether)

용리액으로 선정된 methanol을 이용하고 본 연구에 적당한 카트리지를 정하기 위하여 Sep-pak tC₁₈ cartridge와 Oasis HLB cartridge 2 종(60 mg과 200 mg)을 이용하여 회수율 실험을 하였다. 활성화 시킨 cartridge에 phenol 표준용액을 5.0 ng을 첨가하고 methanol 5 mL로 용리시켜 분석하였다. 그 결과를 tC₁₈를 사용한 경우는 회수율이 10.8±2.9% (n=3)로 낮게 나타나 본 연구에는 사용할 수 없었다. HLB cartridge 경우 두 종류 cartridge 모두에서 100%의 희수율을 보여 본 연구에 사용하기에 적합한 것으로 판단되었다.

시료 고체상 추출에 의한 농축시 pH의 영향을 알아 보기 위하여 pH 2~10까지 단계별로 추출 분석하여 본 결과를 Table 4에 나타내었다. 보통 수질시료를 분석할 때 시료를 채취하는 과정은 최소한으로 하는 것이 바람직하다. 따라서 분석하는 화합물의 함량은 pH의 영향이 가장 중요하다고 알려져 있다. 표에 나타난 바와 같이 pH 4일 때 회수율 83%를 정점으로 감소하는 경향을 나타내어 다른 문헌²의 결과와도 일치함을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 하여 실제 시험법에서는 시료 채취시 인산(1+10)을 가지고 pH를 3으로 조절한 후 실험실로 옮겨서 고체상 추출법 이용 시료를 정제 및 농축하여 분석 하였다.

Table4.

Recoveries of phenol as changed pH using HLB cartridge (Applied to 200 mL of sample spiked with 0.5 ng of phenol)

수질중에 미량으로 존재하는 페놀을 분석하기위하여 많은 농축이 필요하며 시료량이 많을 경우에는 카트리지에 흡착되었던 물질이 용리되는 일어나 분석효율을 저하시키는 원인이 된다. 본 연구에서 적당한 카트리지를 선정하기위하여 카트리지의 고체상의 양에 따라, 분석하는 시료량에 따른 추출효율의 변화를 살펴보았다. 카트리지의 용량이 60 mg과 200 mg인 것을 사용하고 시료량을 300 mL에서 1500 mL까지 변화시키면서 회수율의 분석하여 그 결과를 Table 5에 나타내었다.

Table5.

Recoveries of phenol at changing sample volumes according as sorbent amounts

페놀 표준용액을 이용하여 각 용액에 5.0 ng 씩을 첨가하여 카트리지에 주입한 후 용리시켜 분석하였다. 시험용액의 부피가 60 mg 카트리지는 500 mL, 200 mg은 1000 mL를 넘으면 흡착된 페놀이 용출되어 회수율이 떨어지는 것으로 시험결과에 나타났다. 실제 시료의 분석시 페놀의 함량에 따라 시료량을 적절히 변화시켜 재 용리되는 것을 막아야한다.

고체상에 흡착된 페놀을 용리시키는 용매의 최적량을 측정하기위하여 페놀 5.0 ng을 주입한 후 용출용매를 1 mL씩 순차적으로 받아서 분석하였다. 분석결과 4 mL까지의 용리액에서 90%이상 용출되었다. 이러한 결과에 따라 본 실험에서는 메탄올 5 mL를 사용하여 분석물질을 용리시키고 질소기체를 이용하여 1 mL로 농축하여 시험용액으로 하였다.

이와 같은 시험결과를 모두 고려하여 본 연구에서는 HLB 3 cc/60 mg cartridge를 사용하고 시료량은 1 L 이내로 하여 Scheme 1의 시험법에 따라 페놀을 전처리하여 분석하는 방법을 확립하였다.

3.4. 분석방법의 신뢰도

본 연구에서 확립한 고체상추출법을 이용한 HPLC 분석방법의 신뢰도를 확인하기 위하여 농도가 0.5 μg/mL인 페놀 표준용액을 증류수에 첨가하여 Scheme 1의 방법에 따라 5회 반복하여 실험하였으며, 그 결과 전체적인 회수율은 86~89%±1.2 (평균 87.0%, n=5)로 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

또한 페놀의 농도에 따른 정량성을 알아보기 페놀의 첨가량을 1.0 ng~10 ng 범위에서 변화시키면서 Scheme 1의 방법에 따라 정제 농축 분석을 하였다. 분석결과 회수율은 89.9±7.1% (n=3)이었고, 이때에 상관계수 R²=0.999로 좋은 직선성 및 정량성도 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 본 연구에서 설정 확립한 Scheme 1에 나타낸 페놀분석법은 실제로 수질시료에 적용하여 분석할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig.5.

Calibration curve for phenol.