2.1. 시약 및 재료

일차표준용액 제조에 쓰인 콜레스테롤 고 순도 표준물질은 National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Material (SRM) 911c를 사용하였다. 동위원소표지물질 표준용액을 제조하기 위한 동위원소표지 표준물질은 cholesterol-d₄ (C/D/N Isotopes Inc, 99.4%)를 사용하였다.

본 실험의 분석법 개발에 사용된 시료는 남양유업에서 인증표준물질 용도로 특별히 제조된 균질화된 분유시료와 NIST에서 제공하는 분유 표준물질 SRM 1849a를 사용하였다. 에탄올과 메탄올은 HPLC 등급으로 Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA)에서 구입하였고, 헥산(ACS grade)과 수산화칼륨(ACS grade)은 Sigma-Aldrich 회사에서 구입하였다. 이동상인 메탄올과 증류수는 사용하기 전에 0.22 µm PVF (Polyvinylidene fluoride) membrane filter (Milipore, USA)로 여과하여서 사용하였다. 증류수는 reverse osmosis system과 Milipore Alpha Q purification system을 차례로 통과하여 유기, 무기 불순물을 제거한 초순수를 사용하였다.

2.2. 기기 및 실험조건

무게측정 시 사용하는 화학저울은 0.01 mg에서 200 g까지 측정할 수 있는 analytical balance (AT201, Mettler Toledo)와 0.1 µg에서 2.1 g까지 측정 가능한 microbalance (UMX, Mettler Toledo)를 사용하였다. 표준용액 제조 시 미량의 시료를 측정하기 위해 온도에 의한 열팽창계수가 적은 백금 팬(Pt pan)을 사용하여 무게를 측정하였다. 시료를 측정하기 위한 분석 장비로 고성능 액체크로마토그래피는 Agilent Technologies의 1100 series (Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. 액체크로마토그래피 컬럼으로는 Phenomenex사의 Kinetex C₁₈ (2.6 µm, 2.1×50 mm) 컬럼을 사용하였고 보호 컬럼으로는 Phenomenex사의 SecurityGuard ULTRA C₁₈ (2 µm, 2.1×2 mm)을 사용하였다. 질량분석기는 대기압 화학 이온화 장치(Atomospheric pressure chemical ionization interface)를 장착한 ABsciex의 API 4000 triple quadrupole mass spectrometer를 사용하였다. 자세한 기기 조건은 아래 Table 1과 Table 2에 나타내었다.

Table1.

HPLC Conditions for the analysis of cholesterol in infant formula

Table2.

Optimized mass spectrometer conditions for the analysis of cholesterol in infant fomula

2.3. Exact signal matching method

일반적으로 동위원소희석 질량분석법의 교정방법에는 Graphical method, Bracketing method, Single point calibration, Exact signal matching method 등이 있는데 본 연구에서는 Exact signal matching method를 사용하였다. 이 방법은 시간이 많이 소모되나 매우 정확하며 계통오차를 상쇄시킬 수 있으므로 불확도 값을 줄일 수 있으며, 유기물, 무기물 측정 모두에 사용될 수 있다.¹⁴ 이 방법의 순서도를 Fig. 1에 그림으로 나타내었다. 이 방법은 먼저 시료 속에 들어있는 분석대상물의 농도 추정이 이루어져야 한다. 다음 추정한 농도에 해당하는 무게의 동위원소 화합물을 시료에 첨가한 다음 시료의 전처리 과정을 실시한다. 다음 시료의 분석대상물 농도에 해당하는 분석대상물과 동위원소 화합물의 혼합표준용액을 제조한다. 혼합표준용액과 함께 동위원소 화합물이 첨가된 시료의 동위원소화합물비를 구하여 시료의 분석대상물 농도를 계산한다. 이때 사용된 농도 계산식은 아래 식 (1)에 나타내었으며 측정된 농도값이 일정한 값에 수렴할 때까지 반복하여 결정한다.

Fig. 1.

Schematic representation of the ‘exact signal matching’ IDMS procedure as applied to organic analysis.

M_{is-sol,spiked} - 시료에 첨가된 동위원소표지물질 표준용액의 무게

M_s-sol,std - 혼합표준용액에 투입한 동위원소표지물질 표준용액의 무게

M_is-sol,std - 혼합표준용액에 투입한 대상성분 고순도 시약 표준용액의 무게

AR_sample - 시료 속 두 물질의 정량이온 크로마토그램 피이크의 면적비

AR_std - 표준용액 속 두 물질의 정량이온 크로마토그램 피이크의 면적비

W_s - 시료 양

C_s-sol - 고순도 시약의 표준용액 농도이다

불확도 평가는 ISO guide에 따라서 하였으며 본 연구에서는 혼합 표준용액의 불확도, 순도의 불확도, 반복 측정의 불확도를 합성하여 최종 불확도를 산출하였다.^15-16

2.4. 일차표준용액(Calibration Standard Solution) 제조

일차표준용액 제조는 콜레스테롤을 200 mg/kg 수준이 되도록 제조한다. 콜레스테롤 고순도 시약을 백금 팬에 약 4 mg을 취하여 그 무게를 정확히 측정한 후 갈색병에 옮긴다. 시약이 들어있는 갈색병에 95% 에탄올 20 mL을 넣어, 에탄올을 첨가하기 전과 첨가한 후의 무게를 정확히 측정하고 시약을 완전히 용해시켜 표준용액을 제조한다.

2.5. 동위원소표지물질 표준용액 (Isotope Labeled Standard Solution) 제조

동위원소표지물질 표준용액 제조는 콜레스테롤-d₄을 200 mg/kg 수준이 되도록 일차표준용액 제조와 같은 방법으로 제조한다. 즉, 콜레스테롤 동위원소표지물질 표준물(isotope labeled standard) 시약을 백금 팬에 약 4 mg을 취하여 그 무게를 정확히 측정한 후 갈색병에 옮긴다. 시약이 들어있는 갈색병에 95% 에탄올 20 mL을 넣어, 에탄올을 첨가하기 전과 첨가한 후의 무게를 정확히 측정하고 시약을 완전히 용해시켜서 표준용액을 제조한다.

2.6. 동위원소비 표준용액 (Isotope Ratio Standard Solution) 제조

일반적으로 동위원소비 표준용액은 분석대상물질 표준용액과 그것의 동위원소표지물질 표준용액의 비가 1:1에 가깝게 제조된 용액을 말한다. 앞서 제조한 일차표준용액과 동위원소표지물질 표준용액을 1:1로 중량법적으로 혼합하여서 제조하였다.

2.7. 시료 전처리

분유 분말시료 0.1 g을 무게를 측정한 갈색병에 담아 시료의 무게를 측정하고 분석대상성분과 그들의 동위원소표지물질의 비가 1:1이 되도록 동위원소표지물질 표준용액 일정량을 첨가한 후에 다시 무게를 측정한다. 8 M 수산화칼륨 수용액 0.8 mL와 무수에탄올 4 mL를 첨가하여 70 ℃ 상태에서 3 시간 동안 반응시킨 후에, 실온에서 충분히 식혀준다. 헥산 10 mL를 넣어 강하게 교반한 후에 상이 분리될 때까지 방치하여 상층액(헥산층)을 취한 후에, 35 ℃ 상태에서 질소가스를 이용해서 헥산을 완전히 휘발시킨다. 잔류물에 에탄올 1 mL를 가하여 시료를 완전히 용해시킨다. 0.22 µm membrane filter로 여과시킨 후에 에탄올로 희석하여 액체크로마토그래피의 자동분석기에 주입하여 분석을 수행한다. 만약, 전처리가 완료된 후에 시료를 바로 분석하지 않는 경우, 4 ℃ 냉장고에서 직사광선을 차단한 상태로 보관한다.

2.8. 측정 과정

자동분석기에 넣은 시료는 1:1 혼합표준용액, 시료의 순으로 4 번 정도를 반복하여 측정한다. 측정 결과는 피이크의 면적값으로부터 계산된다. 그러므로 면적의 계산은 대단히 중요하다. 일반적으로 얻어진 크로 마토그램의 면적은 사용 software에 의해 자동으로 계산되어지나 이 때의 바탕선이 항상 일정한 상태를 유지하는 것이 아니므로 반드시 확인이 필요하다. 자동으로 계산되어진 면적 비의 재현성이 0.5% 이상일 경우는 수동으로 확인하는 과정이 필요하다.

3.1. 시료 전처리의 최적화

분유는 콜레스테롤 이외의 지질류와 단백질, 탄수화물, 비타민 등과 같이 여러 가지 영양소들로 이루어져 있다. 이 속에서 콜레스테롤을 분석하기 위해서는 시료의 추출과 정제 과정이 필요하다. 콜레스테롤은 유리형 콜레스테롤과 에스테르형 콜레스테롤이 존재하는데 분유속에 존재하는 에스테르형 콜레스테롤을 분석하기 위해서는 유리형 콜레스테롤로 바꿔주는 반응이 꼭 필요하다. 에스테르형 콜레스테롤을 유리형 콜레스테롤로 바꿔주는 반응을 비누화 반응이라고 한다. 지방산이 결합되어 있는 에스테르형 콜레스테롤에 수산화칼륨과 같은 강염기를 첨가하면 비누화 반응이 일어나 알코올이 생성되어 유리형 콜레스테롤로 변환된다. 우선 분유 시료를 전처리하는 과정에서의 비누화 반응의 유무에 따른 콜레스테롤 함량을 비교하였다. 비누화 반응을 하지 않은 시료의 결과와 비누화 반응으로 처리한 시료의 결과가 차이가 있음을 알 수 있었다. 결과는 Fig. 2에 나타내었다.

Fig. 2.

Comparison between saponification and non-saponification in pretreatment process for the analysis of cholesterol in infant formula.

Fig. 2의 결과를 통해서 분유 시료의 콜레스테롤 함량을 분석할 때에 비누화 반응이 꼭 필요하다는 것을 확인하였다. 비누화 반응에 영향을 주는 요인은 크게 온도, 반응시간, 수산화칼륨 용액의 농도가 있다.

우선 비누화 반응의 최적 온도를 알기 위해 상온에서부터 70 ℃ 까지 각각 3 개씩의 시료를 취하여 실험을 진행하였고 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 50 ℃ 이하의 온도에서는 안정성 있는 결과를 보이지 않았고 60 ℃ 이후의 온도에서 반응이 일어났을 때 콜레스테롤의 농도에 안정성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 보다 안정된 결과를 위하여 70 ℃를 최적 온도로 결정하였다

Fig. 3.

Concentration of cholesterol in infant formula according to saponification temperature.

다음은 비누화 반응시간의 최적화를 위한 실험을 진행하였다. 시작점, 0.5, 1, 2, 3 시간의 간격에 따른 비누화 반응의 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 비누화 반응은 비교적 쉽게 일어나는 반응이라 1 시간 후에 반응의 평지점에 이르고 측정 결과 간에도 반복성이 있음을 확인할 수 있었다. 이를 근거로 안정된 반응 조건을 주기 위해 본 연구에서는 3 시간의 반응시간을 최적 시간으로 결정하였다

Fig. 4.

Concentration of cholesterol in infant formula according to saponification time.

수산화칼륨의 농도에 따른 비누화 반응의 최적화 실험을 진행하였다. 동일한 시료에 대해 수산화칼륨의 농도만 달리하고 반응 온도와 시간은 동일하게 실험하였다. 첨가된 8 M KOH 용액의 양을 분유 시료의 양에 대해 normalize하여 측정 결과를 Fig. 5에 나타내었다. Fig. 5의 결과를 확인해보면 분유 시료 1 g당 KOH mol수가 40 mmol 이상일 때가 가장 적합한 것을 확인할 수 있었다. 이는 분유시료 0.1 g에 대해 8 M KOH 용액 약 0.4 mL에 해당하는 양으로 본 연구에서는 안정된 반응조건을 제공하기 위해 0.8 mL를 최적 조건으로 확인하였다.

Fig. 5.

Concentration of cholesterol in infant formula according to KOH concentration.

3.2. 혼합표준용액의 검증

혼합표준용액의 정확성을 검증하기 위해 4 개의 혼합표준용액을 제조하여 LC-MS/MS 실험을 5 회 반복한 후 콜레스테롤/콜레스테롤-d₄ 피이크 면적비를 무게비로 나눈 response factor를 서로 비교하였다. 각 혼합표준용액의 면적비를 무게비로 나눈 값을 얻음으로써 측정기기의 반복성 뿐 만 아니라 제조 과정의 우발오차도 알 수 있다. 이를 Table 3에서 나타내었으며 상대표준편차가 0.13%로 반복성이 좋았으므로 혼합표준용액 제조과정에서 실수가 없었고, 실험 기간동안 기기의 장기적 감도변화도 없었음을 알 수 있었다. 이 혼합표준용액 가운데 가장 평균값에 근접하고 표준편차가 작은 용액을 선택하여 콜레스테롤 정량을 위한 표준용액으로 사용하였다.

Table3.

Relative response factors of cholesterol calibration standard mixtures

3.3. 분유 속 콜레스테롤 측정결과

분유 속 콜레스테롤 분석의 일차분석법으로 개발된 동위원소희석 액체크로마토그래피 질량분석법의 유효화는 NIST SRM 1849a의 분석을 통해 검증되었으며, 분유시료의 측정결과의 반복성 및 재현성에 대한 검증을 통하여 분유 속 콜레스테롤에 대한 인증값을 결정하였다.

3.3.1. 측정방법의 유효화

본 연구에서 개발된 분석법의 유효성을 확인하기 위하여 NIST SRM 1849a를 동일한 방법으로 측정하였다. NIST에서 제공하는 분유 속 콜레스테롤의 인증값은 (137.4±2.9) mg/kg이다. NIST의 인증값과 본 연구에서 개발한 ID LC-MS/MS 분석법을 이용하여 측정한 결과를 Table 4에 나타내었다. 동위원소희석 액체크로마토그래피 질량분석법을 이용한 측정값은 (138.0±3.0) mg/kg으로 인증값과 서로의 불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인할 수 있으며, 이로써 분석법의 유효성을 확인할 수 있었다.

Table4.

Comparison between the measured values and the certified value of NIST SRM 1849a

^aThe expanded uncertainty is at the 95 % level of confidence.

^bMeasurement was carried out with multiple subsamples (n=3).

3.3.2. 반복성과 재현성

본 실험에서 반복성을 알기 위해 한 뱃치내에서 3개씩의 시료를 취하여 동위원소표지물질 표준용액 일정량을 첨가한 후 동일한 전처리 과정을 거쳐서 LC-MS/MS의 선택반응분석법(MRM) 모드에서 4회 반복 측정하여 분석하였다. 또한 이 방법의 재현성을 검증하기 위해서 동일한 반복성 실험을 서로 각각 다른 날짜에 3 회 수행하였고 그 결과를 Table 5에 나타내었다.

Table5.

Repeatability and reproducibility of cholesterol measurement by the developed ID-LC/MS/MS method applying to homogenized infant formula

^aThe expanded uncertainty is at the 95 % level of confidence.

분석 결과 첫 번째 시기부터 세 번째 시기까지의 상대표준편차는 0.3%, 0.5%, 0.6%로 1% 이내의 반복성을 보였으며, 3 회를 반복하여 독립적으로 측정한 측정값의 상대표준편차는 0.23%로 높은 재현성을 보였다. 이로써 본 연구에서 개발한 방법의 유효성과 정확성을 확인할 수 있었으며 분유 속에 들어 있는 콜레스테롤 함량은 (459.4±8.9) mg/kg의 결과를 보였다.