1. 서 론
1983년 Kary Mullis에 의해 개발된 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase chain reaction)은 DNA의 일부분을 증폭시키는 기술로서 분자생물학 발전에 큰 영향을 끼쳐왔다1. PCR은 사용 목적에 따라 다양한 분석 방법이 개발되어 왔다.2-4 DNA감식에 의한 개인식별과 신원확인은 법과학 분야에 혁명적 발전을 가져왔으며, 지문분석과 함께 막강한 도구로 자리 잡고 있다. 현재 STR좌위의 분석은 개인식별에 가장 유용하게 사용되는 DNA감식 수단이며,5-7 PCR 증폭기는 성공적인 DNA감식을 결정하는 가장 중요한 장비 중 하나이다.
최근 미국의 스타트업 기업인 Amplyus사(Cambridge, MA, USA)에서 손 안에 들어올 정도로 크기가 작고, 스마트폰 어플을 이용해 PCR 증폭조건을 설정하고 모니터링 할 수 있으며, 기존의 일반적인 PCR장비에 비해 가격이 1/10정도로 저렴한 MiniPCRTM mini8 Thermal Cycler (이하 MiniPCR)를 개발하였다(Fig. 1).
본 연구에서는 MiniPCR의 성능을 현재 많은 DNA감식 실험실에서 사용 중인 GeneAmp PCR systems 9700 thermal cycler (Life Technologies, 이하 9700)와 비교해 보았다. 이를 위해 개인식별과 신원확인에 주로 사용되고 있는 상 염색체 STR 다중증폭키트인 AmpFlSTR Identifiler amplification kit (이하 ID), AmpFlSTR Identifiler Plus amplification kit (이하 ID plus), GlobalFilerTM PCR amplification kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, 이하 GF), PowerPlex® Fusion system (Promega, Madison, WI, USA, 이하 Fusion)과 Y 염색체 STR 다중증폭키트인 PowerPlex®Y23 system (Promega, Madison, WI, USA, 이하 Y23)를 사용하여 DNA 농도에 따른 증폭 민감도 및 대립유전자 증폭 불균형(Stochastic effect)정도를 분석하였다. 또한 분해된 시료 등과 모계 혈통 확인에 주로 사용되는 미토콘드리아 DNA의 HV1과 HV2의 염기서열을 분석하여 두 PCR 장비의 성능을 비교하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. DNA 시료
본 실험에서는 DNA감식의 표준 DNA인 2800M DNA (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였다. DNA는 연속 2 배 희석하여 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/µL의 농도로 준비하였다.
2.2. 증폭 및 모세관 전기영동
각 STR 다중증폭 키트들의 반응액 조성과 증폭 조건은 제조자의 지시에 따랐다(Table 1). 각 PCR 장비에서 증폭된 PCR 산물 1 µL에 GeneScan 600 LIZ size standard (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 0.4 µL 그리고 Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 9.6 µL를 혼합한 후, 3500 xl genetic analyzer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 전기영동을 수행하였으며, GeneMapper ID-X 소프트웨어 v1.4 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 엑셀 프로그램(Microsoft)을 사용하여 결과를 분석 하였다.
2.3. 미토콘드리아 DNA HV1/HV2 염기서열 분석
미토콘드리아 DNA의 과변이부위(Hypervariable region)인 HV1과 HV2의 증폭과 염기서열 분석을 위해 Gold ST★R 10X buffer (PROMEGA, Madison, WI, USA), AmpliTaq DNA polymerase 1.25 unit에 프라이머(F15910/R16410 및 F15/R484, 10 mM each)를 넣고 반응 시켰다.8 PCR산물의 확인을 위해 Agilent DNA kits(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하였다.
3. 결 과
3.1. 민감도
MiniPCR과 9700을 이용해 STR 다중증폭키트를 각 농도 별 표준 DNA시료에서 증폭한 후, 피크의 높이(peak height)와 대립유전자의 검출율을 비교하였다. Agilent 2100 Bioanaylzer를 이용해 확인한 PCR 증폭 산물과 Genetic analyzer와 GeneMapper를 이용해 분석한 STR plot은 Fig. 2와 같다. 실험에 사용한 네 가지 종류의 상 염색체 STR 다중증폭키트들은 모두 31.25 pg/µL 이상의 DNA에서 MiniPCR과 9700사이에 피크 높이에 큰 차이 없이 성공적으로 증폭되었다(Fig. 3). 그러나 Y23 키트의 경우에는 MiniPCR에서 9700에 비해 상대적으로 낮은 피크 높이를 보여주었다. 또한 각 STR 다중 키트 별로 대립유전자 검출율을 비교한 결과 MiniPCR과 9700 사이에 큰 차이가 없었다(Fig. 4).
3.2. 대립유전자 증폭 불균형 분석
DNA의 농도가 낮을 경우에 나타나는 이형접합 대립유전자의 증폭 불균형 현상(stochastic effect)은 PCR 다중증폭키트는 물론이고 PCR 증폭기의 성능을 비교할 수 있는 기준이 된다. MiniPCR과 9700을 사용해 증폭한 다섯 가지의 STR 다중증폭키트 모두에서 이형접합 대립유전자 증폭 산물의 피크 및 좌위의 균형에 큰 차이가 없었다(Fig 5).
3.3. 미토콘드리아 DNA HV1/HV2 염기서열 분석
법과학 분야에서 미토콘드리아 DNA 분석은 오래되거나 변질되어 핵 DNA의 분석이 불가능할 경우나 신원확인을 위해 모계 혈통 분석이 필요한 경우에 사용된다. 미토콘드리아 DNA의 HV1 (16024-16365)과 HV2 (73-340)은 사람마다 염기서열에 차이가 있는데, 염기서열 분석을 위해 먼저 PCR을 통해 두 부분을 증폭해야 한다. MiniPCR과 9700을 이용해 HV1과 HV2를 증폭한 후 염기서열을 분석해 비교한 결과, 모두 동일한 염기서열을 얻을 수 있었다(Fig. 6).
4. 고 찰
PCR은 DNA 감식은 물론이고 거의 모든 생명과학 분야에서 필수적인 분석 방법이 되었다. 지금까지 수많은 PCR 증폭기가 개발되어 실험실에서 사용되고 있는데, 대부분 가격이 비싸고 부피가 커서 실험실이 아닌 곳에서는 사용할 수 없었다. 본 연구에서는 작고 저렴한 MiniPCR 장비의 성능을 검토하기 위해 DNA 감식 실험실에서 개인식별과 신원확인을 하기 위해 일반적으로 수행되고 있는 STR 다중증폭과 DNA 염기서열 분석을 수행하여 기존의 일반적인 PCR 증폭기와 비교하였다. 본 연구에 사용된 STR 다중증폭키트들은 최소 15 개에서 23 개의 좌위를 동시에 증폭할 수 있는데, MiniPCR과 9700에서 거의 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 또한 두 장비를 사용해 미토콘드리아 DNA HV1/HV2의 염기서열 분석을 위한 PCR을 수행하여 그 결과를 비교한 결과도 큰 차이가 없었다. 본 연구에서 수행한 MiniPCR의 성능은 가격과 작은 부피를 감안하면 현재 사용되고 있는 고가의 PCR 장비를 충분히 대체할 수 있으며, 나아가 범죄현장 등 야외에서도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료 된다.
References
PCR Protocols. Methodsin Molecular Biology (, , (2nd ed.)) ((2003)) Bartlett, J. M. S. and Stirling, D. “A Short History of the Polymerase Chain Reaction”. PCR Protocols. Methodsin Molecular Biology, 226 (2nd ed.). pp. 3-6. doi: 10.1385/1-59259-384-4:3. ISBN 1-59259-384-4 (2003). , pp. 3-6, “A Short History of the Polymerase Chain Reaction”