2.1. 시약 및 재료

Atenolol, propranolol, metoprolol, cefaclor, amoxicillin, penicillin-G의 표준물질로는 Sigma-Aldrich사(St Louis, MO, USA)의 고순도 시약을 사용하였다. Cefadroxil과 cefradine은 Dr. Ehrenstorfer GmbH사(Augsburg, Germany), cefalexine은 USP사 (Rockville, MD, USA)의 고순도 시약을 사용하였다. 대체표준물질로서 Cambridge Isotope Laboratories사(CIL, Tewksbury, MA, USA)의 ¹³C로 치환된 amoxicillin-¹³C₆과 Sigma-Aldrich사(St Louis, MO, USA)의 atenolol-d₇을 사용하였다. 메탄올, 아세토나이트릴 등의 용매는 J.T. Baker사(NJ, USA)의 HPLC 등급 시약을 사용하였고, 폼산은 Sigma-Aldrich사(St Louis, MO, USA), 아세트산은 DUKSAN사(Gyeonggi-do, KOREA)의 시약을 사용하였다. Waters사의 Oasis HLB (200 mg, 6mL)와 MCX(150mg, 6 mL) 카트리지를 사용하였다.

2.2. 기기 및 장치

시료의 추출은 자동고체상 추출장치(Dionex Autotrace 280, Thermo Scientific, USA)를 사용하였으며, 농축장 치는 Biotage사(Turbo Vap LV, USA) 질소 증발농축기를 사용하였다. 시료 자동 주입기가 장착된 고성능 액체 크로마토그래프(Agilent 1200 Series, Germany)와 Triple quadrupole 질량 분석기(Thermo electron사, TSQ Quantum Ultra, USA)을 사용하여 시료를 분석하였다. 컬럼은 Agilent XDB-C₁₈ (1.8 μm, 100 × 3.0 mm)를 사용하였다.

2.3. 시료 채취

본 연구의 전처리 및 분석 방법을 이용하여 β-차단제와 β-락탐계 항생제를 분석하기 위해 한강으로 유입되는 지천 두 곳(경안, 왕숙)과 원수 세 곳을 지정하여 채취하였다. 채취 시 깨끗이 세척된 4 L 갈색유리병(PTFE 코팅된 격막을 장착한 마개)을 사용하였으며, 시료는 냉장보관(4 ℃)하여 가능한 즉시 분석하였다.

2.4. 실험방법

2.4.2. 시료의 전처리

시료를 1.2 μm glass microfibre filter로 1차 여과하고 0.45 μm PTFE filter로 2차 여과하였다. 5 % EDTA-Na2 1mL를 첨가하고 3.5 M 황산을 첨가하여 pH 2로 조정하였다.

Oasis HLB (200 mg, 6 mL) 카트리지는 메탄올, 아세토나이트릴, 0.5 N 염산, 증류수를 차례대로 3 mL씩 통과시켜 컨디션한 후, 시료를 적재하고 질소를 이용하여 40 분간 건조 시켰다. 용출은 아세토나이트릴과 메탄올로 용리하였으며 카트리지를 건조한 후, 0.1 % 폼산이 들어 있는 증류수와 아세토나이트릴(80:20)을 500 μL로 재용리 하였다.^8,11

Oasis MCX (150 mg, 6 mL) 카트리지에 메탄올 6 mL, 증류수 3 mL를 흘려보내 카트리지를 컨디션 한 후 시료 500 mL를 10 mL/min 속도로 적재했다. 질소가스로 40 분간 카트리지를 충분히 건조시킨 후, 메탄올에 2% 수산화암모늄을 넣은 용액 3 mL, 2회로 용리시켰다. 용리액은 질소증발기(Biotage사, TurboVap^® LV, USA)를 이용하여 3 psi의 질소 공급 하에서 완전히 증발시킨 후 0.01 % 아세트산이 들어있는 증류수(pH 3.5) 500 μL로 용해하여 2 mL 갈색 바이알에 옮겨 HPLC-MS/MS로 분석하였다. 전처리 흐름도는 Fig. 1과 같다.

Fig. 1.

Schematic diagrams of sample preparation using HLB cartridges (1) and MCX cartridges (2) for β-blockers and β-lactam antibiotics

2.4.3. HPLC/ESI-MS/MS

0.1 % 폼산을 첨가한 정제수를 이동상 A로 사용하였고, 아세토나이트릴을 이동상 B로 하였다(Table 2). 일반적으로 폼산과 같은 휘발성 산은 LC-MS, LC-MS/MS 등의 분석에 이동상 첨가제로서 많이 사용하는데 이동상을 낮은 pH로 유지함으로써 컬럼 표면에 잔류하는 실라놀 그룹(silanol groups)의 이온화를 최소화하여 좋은 감도의 피크를 유지하기 위해서이다.¹²

Table2.

LC-MS/MS conditions for analysis of β-blockers and β-lactam antibiotics

분자량에 양성자 1개가 결합된 [M+H]⁺가 일반적인 이온화 형태이므로 ESI 양이온 모드에서 선구이온과 생성이온, 그리고 정량이온을 선택하여 분석하였다. 정량이온과 정성이온을 얻기 위해서 양이온(+)모드에서 full scan을 통해 질량 스펙트럼을 얻은 후, 기준이온(base ion)을 선구이온(precursor ion)으로 선택하였다. 선택된 선구이온에 최적의 충돌 에너지(collision energy)를 가함으로써 안정되고 감도가 높은 생성이온(product ion)을 만들어서 정량 및 정성확인에 사용하였다(Table 3).

Table3.

Precursor ion, product ion and collision energy of β-blockers and β-lactam antibiotics

3.1. HLB/MCX 카트리지의 정도 관리

분석 대상 물질들의 정확도와 정밀도를 비교하기 위해 HLB 카트리지와 MCX 카트리지를 각각 사용하여 정도관리를 수행하였다. HLB 카트리지는 모든 화합물을 위한 친수성(hydrophilic)-친유성(lipophilic) 균형 흡착제의 역상 흡착제이며 MCX 카트리지는 혼합 모드 양이온 교환(Cation-exchange) 및 염기성용 역상 흡착제이다.¹³ HLB 충진물은 친수성의 스타이렌 기본구조의 폴리머로 동일한 시료의 추출조건에서 극성과 무극성 물질을 동시에 추출할 수 있는 장점을 가지고 있어 현재 가장 많이 사용되고 있는 카트리지이다.

MCX 카트리지는 복합중합체(poly-divinylbenzene-co-N-vinylpyrrolidone copolymer) 표면에 강한 양이온 교환기인 설폰산 그룹이 배치되어 산성 조건에서 물질들의 아민기에 양이온으로 전환(NH₂RR’⁺)이 일어나고 MCX상에 있는 설파이트기(−SO₃⁻)와 강한 상호작용이 일어난다.¹³ 염기성 용리액에 의해서 양이온 형태로 흡착되어 있던 분석물질이 중성형태로 바뀌면서 정전기적 상호작용이 끊어지고 메탄올이 비극성 상호작용을 방해하여 분석물질이 용리되어 높은 회수율을 보였다. 대부분의 β-차단제는 산성조건에서의 반응이 용이하며 강한 양이온 교환상인 MCX 카트리지로 선택적으로 추출을 한다. 본 연구에서도 중성과 산성 화합물의 대부분은 MCX의 역상 작용기에 의해 물질의 손실 없이 용리단계를 거쳐 HLB 카트리지로 추출한 시료의 정밀도(Relative standard deviations, RSD) 8~30% 보다 MCX 카트리지로 추출한 시료는 6~17 %의 높은 정밀도를 나타내었다(Table 4).

Table4.

Instrumental performance and validation data using different cartridges of β-blockers and β-lactam antibiotics

^a,b)Calculated based on the peak area corresponding to 5 ng/L (n = 7)

3.2. 한강 수계에서의 검출 현황

정도관리 결과를 토대로 정밀도와 정확도가 높은 MCX 카트리지를 이용한 전처리방법으로 한강으로 유입되는 지천과 원수에 대하여 실태조사를 하였다(Table 5).

Table5.

Concentration of β-blockers and β-lactam antibiotics in the Han River (μg/L)

^a)N.D. (Not detected)

유럽의 지표수에서는 자주 처방되는 의약물질에 해당하는 metoprolol이 0.003~2.2 μg/L 농도로 검출되었고 atenolol은 0.009~0.250 μg/L 농도로 검출되었다. 우리나라의 경우 Lee et al.(2013) 연구팀이 낙동강 본류보다 금호강이 낙동강으로 합류하는 지점에서 의약물질이 급격히 증가하고 atenolol은 N.D.~0.024 μg/L, propranolol은 N.D.~0.0038 μg/L의 농도범위로 검출되었다고 보고했다. 이는 인구 및 산업 밀집지역의 영향이 큰 것으로 판단되고 갈수기에는 더욱 고농도로 검출되는 것으로 나타났다.^14-17

본 연구의 실태조사에서는 총 9종의 분석물질 중 한강으로 유입되는 지천에서 metoprolol과 penicillin G를 제외한 7 종의 물질이 검출되었다. Atenolol이 0.043~0.209 μg/L로 가장 고농도로 검출되었고, amoxicillin이 0.083~0.163 μg/L 농도 순으로 검출되었다. 유럽의 지표수, 낙동강 수계와 비교했을 때 한강수계에서도 atenolol은 비슷한 농도로 검출되었고 metoprolol은 검출되지 않았다.

β-락탐계열 중 amoxicillin은 유럽, 인도, 브라질 등 여러 국가에서 자주 사용하는 항생제 중 하나이며, 2000~2010년 전 세계에서의 소비율이 35 % 증가했다. 높은 배설률과 9일의 긴 반감기 때문에 하수처리장이나 지표수에서도 검출이 되는 경우가 있다.^18,19

본 연구의 원수에서는 cefalexin 0.013~0.015 μg/L, cefradine 0.008~0.010 μg/L 그리고 atenolol 0.006~0.010 μg/L 3종이 정량한계 수준의 농도로 검출되었다. 외국에 비해 높은 검출 농도와 빈도는 아니지만 정수처리를 통해 제거되는 과정과 새롭게 문제가 될 수 있는 대사산물에 대하여 지속적인 모니터링과 그에 따른 관리가 필요하다.