1. 서 론

비소(Arsenic, As)는 지각과 생물환경 중에 다양한 형태의 화합물로 널리 분포하는 금속물질로서 강한 독성을 가지고 있는 주요 환경오염물질이다. 비소화합물은 미국 환경보호국(Environmental Protection Agency, EPA)과 국제암연구소 (International Agency of Research on Cancer, IARC)에서 인체발암물질로 인간에게 노출된 경우 위해성이 매우 큰 물질로 엄격히 관리하고 있으며,¹ 발암성뿐만 아니라 피부질환과 심혈관계질환 등 인체에 위해성이 높은 화학물질로서 주목받고 있다.^2-3

비소의 인체노출 경로는 주로 경구와 호흡기를 통하므로 직업적으로 비소에 노출되지 않는 일반인들에 있어서 비소의 주요 노출원은 비소에 오염된 물과 토양 및 식품 섭취에 의한 노출이 대부분이다.^4-6 비소는 무기비소인 arsenite (As(III)), arsenate (As(V))와 유기비소인 arsenocholine (AsC), arsenobetaine (AsB), dimethyl arsenate (DMA), monomethyl arsenate (MMA), trimethyl arsenate (TMA) 등 다양한 형태로 존재하며, 일반적으로 비소의 노출에 의해 생체 내에서 확인되는 비소 화학종은 arsenite (As(III)), arsenate (As(V)), dimethylarsinic acid (DMA) 그리고 monomethylarsonic acid (MMA)이다(Fig. 1).⁷

Fig. 1.

Chemical structures of arsenite, arsenate, dimethylarsinic acid, monomethylarsonic acid.

생체 내에서의 arsenate (As(V))는 arsenite (As(III))로 환원되며, arsenite (As(III))은 간에서 methylation작용으로 dimethylarsinic acid (DMA)와 monomethylarsonic acid (MMA)으로 대사되어 체외로 배설되며,⁸ 일반적으로 유기비소인 dimethylarsinic acid (DMA), monomethylarsonic acid (MMA) 보다 무기비소인 arsenite (As(III)), arsenate (As(V))가 독성이 상대적으로 강한 것으로 알려져 있는데 As(III)는 As(V)보다 10배 정도 독성이 강하고 유기비소에 비해서는 70배 정도 독성이 강한 것으로 알려져 있다.^9-10 따라서 비소형태에 따른 독성의 강도가 다름에 따라 어떤 형태의 비소가 존재하는지가 독성연구에서 중요한 요소이며 비소의 위해성을 정확하게 평가하기 위한 비소화학종별 함량 조사연구에 있어서 보다 정확하고 정밀한 비소종의 분리와 분석을 위해서는 감도가 우수한 분석기기 적용에 의한 종 규명분석이 반드시 필요하다.⁹

비소가 환경과 식품 등을 통해 사람에게 노출되어 질병을 유발하기 때문에 환경 및 식품 등에 함유되어 있는 비소 종의 농도와 체내에 있는 비소 종의 농도를 측정하기 위한 선행연구에서는 수중의 비소 종 분리 분석,¹¹ 어류중 비소의 종분화 분석,¹⁰ 수소화물 발생-유도결합 플라즈마 원자 방출 분광법을 이용한 죽염중의 비소 종분리 분석¹² 그리고 HG-AAS법에 의한 요 중 비소의 최적 분석법에 관한 연구¹³ 등의 분석연구에서 다양한 분석기술들이 비소(Arsenic) 종 분리에 적용되어 왔다.^9,10,14 주로 high performance liquid chromatography (HPLC)나 capillary zone electrophoresis와 같은 크로마토그래피 분리법이 이용되며 검출기로는 atomic absorption spectrometry (AAS), atomic absorption spectrometry (HG-AAS), atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS) 또는 inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) 등의 검출기로 정량하는 방법이 이용되어진다.^14-16

다양한 비소 종 분리 및 분석방법 중 최근에는 대부분 HPLC-ICP/MS를 이용하고 있다. HPLC-ICP/MS는 HPLC의 뛰어난 분리능과 ICP-MS의 매우 낮은 검출한계능을 갖춘 분석 장비로써 무기 및 유기 비소종들을 손쉽게 검출할 수 있는 뛰어난 재현성을 보임으로써 활용도가 높아지고 있다.¹⁷ 이러한 ICP-MS의 높은 효율성에도 불구하고 다종 이온 간섭에 의한 질량 겹침과 간섭원에 의해 비소 종 농도의 정확한 정량 분석을 수행하기에는 많은 제약을 주고 있으며 이러한 간섭원은 미량의 비소 종분리 분석에 있어서 중요한 방해요소로 작용하고 있다. 이와 같이 스펙트럼 겹침 현상과 같은 문제점을 해소하기 위해 최근에는 DRC (Dynamic reaction cell)기술을 이용하여 적절한 반응가스(메탄, 산소, 수소, 암모니아 등)로 간섭원을 제거하거나 혹은 분석원을 다른 질량수로 변환시켜 분자종의 간섭없이 완벽히 분석할 수 있는 기술이 도입되고 있다.⁹

최근 국내에서는 생체시료 중 비소를 포함한 중금속을 ICP-MS를 이용한 동시분석에 관하여 많은 연구가 활발히 진행되고 있다.^18-20 그러나, 분석방법이 공식적이고 표준화되어 있지 않은 실정이다. 특히, 혈장 중 비소 분석을 위한 국내/외적으로 통일된 표준분석법이 확립되어 있지 않은 단계이다. 따라서 본 연구는 HPLC-ICP/MS의 DRC 기법을 적용하여 dog 혈장 중 arsenite (As(III)), arsenate (As(V)), dimethylarsinic acid (DMA) 그리고 monomethylarsonic acid (MMA)의 동시 분리 분석을 위한 분석법을 검증하여 미량금속 생체노출 시험법에 기초 자료로 활용하고자 수행하였다.

2. 실험 방법

2.3. HPLC-ICP/MS

분석기기는 Flexar LC (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), NexION300x ICP/MS (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 혈장 중 비소 종 분리 분석을 위하여 ICP/MS의 DRC모드를 이용하여 측정하였으며, 반응기체로 산소(O₂)를 이용하여 질량 값 91로 비소를 분석하였다. 내부표준 물질로 사용된 tellurium은 질량 값 130으로 분석하였다. 이동상은 2 mM sodium phosphate monobasic, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate, 10 mM sodium acetate와 3 mM sodium nitrate를 1 M NaOH를 이용하여 pH 11.0±0.2로 맞춘 후 ethanol을 1 % 되도록 첨가하였다. 비소 종 분리를 위한 컬럼은 Agilent 사의 G3288-80000, 4.6×250 mm (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였으며 비소 종 분리 분석을 위한 HPLC-ICP/MS 기기분석 조건은 Table 1에 나타내었다.

Table1.

HPLC-ICP/MS operating conditions and parameters

3. 결과 및 고찰

HPLC-ICP/MS를 이용한 혈장 중 비소 분석방법의 선택성(특이성)을 평가하기 위하여 6개체의 공혈장을 사용하여 blank, zero blank 및 As(III), As(V), DMA, MMA 와 IS(내부표준물질)이 처리된 LLOQ 농도의 시료를 이용하여 평가하였다(Fig. 2) 분석대상물질이 용리되는 구간에서 간섭피크는 관찰되지 않았으며, 직선성은 각 비소 종에 대한 상관계수 (r²)는 0.99908~0.99949의 범위를 나타내었다(Fig. 3). 검량선의 정확성을 평가하는데 기준인 상관계수(coefficient of correlation, r)는 0.99 이상의 만족하는 결과를 얻을 수 있었다.

Fig. 2.

HPLC-ICP-MS of (A) blank plasma, (B) blank plasma spiked with the four arsenic species at LLOQ (DMA: 5 ng/mL, t_R = 3.2 min; As (III): 5 ng/mL, t_R = 3.7 min; MMA: 20 ng/mL, t_R = 6.4 min; As (V): 5 ng/ mL, t_R = 9.8 min).

Fig. 3.

Representative calibration curves of (A) DMA, (B) As(III), (C) MMA and (D) As(V) in dog plasma.

분석법의 정확성과 정밀성은 분석결과로 얻어진 측정값과 실제값의 근접성을 나타내는 것으로 상대오차 (%RE) 변동계수 (%CV)로 나타내었고, LLOQ를 포함한 4농도를 6반복으로 분석하였으며, 4농도의 정확성 (% RE) 및 정밀성 (% CV)에 대한 배치내 및 배치간의 결과를 Table 2에 나타내었다. 배치내 및 배치간의 정확성 (% RE)과 정밀성 (% CV)은 15% 이내였으며, LLOQ에서는 20% 이내의 범위를 보여 비소 종 분리에 적합한 수준이라 판단되었다.

Table2.

Intra- and inter-batch accuracy and precision of As(III), As(V), DMA and MMA in dog plasma (n=number of samples)

생체시료효과와 회수율은 LQC, MQC 및 HQC의 농도 수준으로 평가하였으며, 그 결과는 Table 3과 4에 나타내었다. 생체시료효과의 결과로 As(III)는 103.7~109.7 %, As(V)는 86.6~97.2 %, DMA는 90.1~97.2 %, MMA는 92.5~100.7 %로 생체시료효과를 나타내었으며, %CV 값은 0.9~7.6 %의 결과를 보였다(Table 3), 회수율은 As(III)는 93.0~99.4%, As(V)는 91.5~97.2%, DMA는 93.0~102.2 %, MMA는 91.8~98.8 %의 범위를 보였고, %CV 값은 3.2~4.8 %의 결과를 나타내어 생체시료효과와 회수율이 15 % 이내의 만족스러운 결과를 확인할 수 있었다.

Table3.

Matrix effect of As(III), As(V), DMA, MMA in dog plasma

Table4.

Recovery of As(III), As(V), DMA, MMA in dog plasma

시스템적합성을 평가하기 위하여 As(III), As(V), DMA, MMA의 LLOQ 농도의 시료를 6회 반복 주입하여 얻은 분석성분의 면적의 %CV 결과는 각각 5.0, 6.5, 3.6, 5.0%로 평가기준에 적합하였다(결과 미제시). 분석법의 희석 영향평가는 고농도의 시료를 동일한 공시료를 이용하여 10 배, 50 배로 각 6 개씩 희석하여 만들어 분석하였고, 측정된 농도의 %RE와 %CV로 평가하였다. 그 결과 %RE는 −13.8~ −6.3 %, %CV 는 0.8~7.7 %의 범위의 결과를 보였다(Table 5).

Table5.

Dilution effects of As(III), As(V), DMA, MMA in dog plasma

분석법 적용 시 시료의 처리과정 중 단기간의 보관, 냉/해동 및 분석과정 진행 후 분석대상물질의 안정성을 평가하기 위해 dog 혈장 내 As(III), As(V), DMA, MMA의 단기 안정성은 약 −80 ℃에서 냉동보관 중이던 LQC와 HQC 농도의 시료를 실온에서 24시간 경과 후 분석하여 평가하였고, 추출 후 안정성은 전처리한 후 실온의 자동주입기에서 47시간동안 보관 후 분석하여 변화율을 확인하였다. 냉/해동 안정성은 LQC와 HQC 농도의 시료를 초회에는 약 −80 ℃에서 24시간 이상보관 후 실온에서 완전히 해동하였으며, 이 후 3번의 냉/해동을 거치는 동안 약 −80 ℃에서 12시간 이상보관 후 실온에서 완전히 해동하여 4번째 냉/해동이 순환이 되었을 때 분석하여 평가하였다. 분석법 적용의 안전성평가 결과는 대상 분석종의 초기 측정된 농도 평균의 ±15 % 이내인 결과를 보였다(Table 6). 본 연구에서 적용된 분석법은 시료의 처리과정 또는 특정시간 동안에 생체시료 내 분석대상 물질이 안정성이 유지되는 것으로 판단되었다.

Table6.

Stability of As(III), As(V), DMA, MMA in dog plasma

4. 결 론

본 연구에서는 혈장 중 비소의 극미량 분석방법을 확립하기 위한 분석 조건을 정립하여 HPLC-ICP/MS를 이용하여 dog 혈장 중 As(III), As(V), DMA, MMA의 분석법을 확립하였다. 본 분석법에서 As(III), As(V), DMA의 정량범위는 5~500 ng/mL, MMA의 정량범위는 20~2000 ng/mL이였으며, 검량선의 평균상관계수(r)는 최소 0.99908이상으로 양호한 직선성을 나타내어 혈장 중 As(III), As(V), DMA, MMA의 농도를 정량할 수 있음을 확인 하였다. 뿐만 아니라 분석법의 선택성, 직선성, 정확성, 정밀성, 생체시료효과, 회수율, 시스템 적합성, 희석도, 안정성 평가를 통해 분석법 검증을 수행하였다. 본 연구를 통해 제시된 분석법은 혈장 중 비소 종의 생체모니터링 관련 응용분야에 유용한 기초 자료가 될 것으로 판단된다.