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GC-MS를 이용한 혈장 중 호모겐티식산의 분석; 알캅톤뇨증의 진단
Determination of homogentisic acid in human plasma by GC-MS for diagnosis of alkaptonuria
분석과학 / Analytical Science and Technology, (P)1225-0163; (E)2288-8985
2015, v.28 no.5, pp.323-330
https://doi.org/10.5806/AST.2015.28.5.323
(덕성여자대학교 약학대학, 생·의약분석실)
(한국마사회, 도핑검사소)
(조선대학교)
(조선대학교)
(덕성여자대학교)
(한국마사회, 도핑검사소)
(조선대학교)
(조선대학교)
(덕성여자대학교)
마헤셜 타파,
유준동,
이원재,
이스람 포크롤,
&
윤혜란.
(2015). GC-MS를 이용한 혈장 중 호모겐티식산의 분석; 알캅톤뇨증의 진단. 분석과학, 28(5), 323-330, https://doi.org/10.5806/AST.2015.28.5.323
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초록
알캅톤뇨증은 극히 드문 희귀 유전성 대사이상질환으로, 호모겐티세이트 디옥시게나제의 부족이나 결손으로 인한 질환이며 호모겐티식산 (HGA)의 축적을 특징으로 한다. 임상적으로는 호모겐티식산 혈증, 관절염 및 퇴자병 (ochronosis) 등을 보인다. 본 연구는 고가이고 시간이 많이 걸리는 고체상 추출단계 없이 신속하게 우수한 감도로 혈장 중 HGA의 정량분석을 위해 개발되었다. 통합 혈장 중 100 µL를 취하여 에틸아세테이트로 액체-액체 추출(LLE)한 후, 트리메틸 실릴 유도체 (TMS) 화한 후 GC-MS로 정량하였다. 카르복실기 및 히드록실 관능기의 TMS 유도체화의 형성은 80 ℃에서 5 분 동안 BSTFA (10% TMCS 포함)로 반응시켜 수행 하였다. GC-MS 의 선택 이온 모니터링을 위한 HGA의 선택 이온은 m/z
- keywords
- Homogentisic acid, Alkaptonuria, Inherited metabolic disease, Gas chromatography-mass spectrometry
Abstract
Alkaptonuria, a rare inherited metabolic disease, is characterized by a lack of homogentisate dioxygenase and accumulation of homogentisic acid (HGA), leading to homogentisic aciduria, arthritis, and ochronosis. In this study, a rapid analytical method, without an expensive and tedious solid phase extraction step, was developed to quantify HGA in plasma using GC-MS. HGA-spiked pooled plasma samples were subjected to liquid-liquid extraction (LLE) with ethyl acetate, followed by trimethylsilyl derivatization (TMS) and GC-MS quantification using selected ion monitoring. The formation of TMS derivative of the 1 carboxylic and 2 hydroxyl functional groups was performed by reacting BSTFA (with 10% TMCS) for 5 min at 80 °C. For selected ion monitoring, quantification and confirmation ions were determined based on specific ions (m/z 384, m/z 341 and m/z 252) of the TMS derivative of HGA. Calibration curves of pooled normal plasma specimens showed a linear relationship in the range of 1-100 ng/μL. The precision and accuracy were within a relative standard deviation (RSD) of 1 to 15% and a bias of -5 to 25%. Recoveries were obtained in the range of 99-125% and 95-115% for intra-day and inter-day assay, respectively, at 2, 20 and 80 ng/μL. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.4 ng/μL and 4 ng/μL, respectively. No homogentisic acid was excreted from normal Korean plasma samples. Collectively, the results from the present study suggest that this method could be useful for routine diagnosis and therapeutic monitoring of alkaptonuria patients with excellent sensitivity and rapidity.
- keywords
- Homogentisic acid, Alkaptonuria, Inherited metabolic disease, Gas chromatography-mass spectrometry
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