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  • P-ISSN1225-0163
  • E-ISSN2288-8985
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23권 6호
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이온쌍 역상 HPLC를 이용한 인체 말초혈액단핵구에서 이노신 5'-일인산 탈수소효소 활성의 정량적 측정

Quantitative determination of inosine 5’-monophosphate dehydrogenase activity in human peripheral blood mononuclear cells by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography

분석과학 / Analytical Science and Technology, (P)1225-0163; (E)2288-8985
2010, v.23 no.6, pp.531-536
https://doi.org/10.5806/AST.2010.23.6.531
신혜진 ((재)서울의과학연구소)
권순호 ((재)서울의과학연구소)
박지명 ((재)서울의과학연구소)
권순효 (순천향대학교)
이경률 ((재)서울의과학연구소)
김영진 ((재) 서울의과학연구소)
이상후 ((재) 서울의과학연구소)
신혜진, 권순호, 박지명, 권순효, 이경률, 김영진, & 이상후. (2010). 이온쌍 역상 HPLC를 이용한 인체 말초혈액단핵구에서 이노신 5'-일인산 탈수소효소 활성의 정량적 측정. 분석과학, 23(6), 531-536, https://doi.org/10.5806/AST.2010.23.6.531
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초록

본 연구에서는 이온쌍 역상 HPLC/UV를 이용하여 건강한 한국인에서 분리된 말초혈액단핵구(PBMCs)에서 이노신 5'-일인산 탈수소효소(IMPDH)의 활성을 측정하였다. IMPDH는 이노신 5'-일인산(IMP)을 잔토신 5'-일인산(XMP)로 전환시키는 베타-니코틴아마이드 아데닌 디뉴클로티드 수화물(<TEX>${\beta}-NAD^+$</TEX>) 의존성 탈수소효소이며, 이것의 활성은 기질인 IMP와 조효소인 <TEX>$NAD^+$</TEX>의 존재 하에서 분해한 PBMCs로 부터 생성된 XMP에 해당하는 HPLC 크로마토그램을 정량적으로 분석함으로써 측정하였다. 생성된 XMP는 260 nm에서 검출하였다. 이동상으로는 7 mM tetra-n-butylammonium hydrogen sulfate가 포함된 37 mM potassium dihydrogen phosphate (pH 5.5)와 methanol의 혼합용액(85:15, v/v)을 사용하였으며, 유속은1 mL/min이었다. 정량 범위는 <TEX>$0.2-50.0\;{\mu}M$</TEX>이었으며, 이 때 정량 한계(LOQ)는 <TEX>$0.2\;{\mu}M$</TEX>이었다. 또한, 본 연구에서 확립된 시험법은 일내 정밀성(0.88-1.47%), 정확성(98.74-99.99%)과 일간 정밀성(0.85-5.24%), 정확성(99.95-101.65%)을 측정하여 검증하였다. 11명의 건강한 한국인에 대한 IMPDH 활성 측정 결과, 18.29-36.60 nmol/h/mg protein(평균값 <TEX>$27.70{\pm}6.28\;nmol/h/mg$</TEX> protein)이었다.

keywords
IMP, XMP, IMPDH activity, PBMCs, HPLC

Abstract

A quantitative analytical method has been established for the measurement of inosine 5’-monophosphate dehydrogenase (IMPDH) activity in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography equipped with ultraviolet detection (HPLC/UV). IMPDH is a β-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD+)-dependent dehydrogenase in which the enzyme converts inosine 5’-monophosphate (IMP) into xanthosine 5’-monophosphate (XMP). Its activity was measured by quantifying a HPLC chromatogram corresponding to XMP produced during the incubation of lysed PBMCs with IMP as a substrate and NAD+ as a coenzyme. XMP produced was detected at a wavelength of 260 nm. The mobile phase was composed of a mixture of 37 mM potassium dihydrogen phosphate containing 7 mM tetra-n-butylammonium hydrogen sulfate adjusted to pH 5.5 and methanol (85:15, v/v) with a flow rate of 1 mL/min. The calibration curve was linear (r2=0.999999) in the range of 0.2-50.0 μM and the limit of quantification (LOQ) was 0.2 μM. The intra- and inter-day precisions were between 0.88-1.47% and 0.85-5.24%,respectively. The intra- and inter-day accuracies were between 98.74-99.99% and 99.95-101.65%, respectively. IMPDH activity in 11 Korean healthy volunteers ranged from 18.29 to 36.60 nmol/h/mg protein (mean = 27.70± 6.28 nmol/h/mg protein).

keywords
IMP, XMP, IMPDH activity, PBMCs, HPLC


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